Zespół długiego QT, zespół Brugadów i choroba układu przewodzącego są powiązane z pojedynczą mutacją kanału sodowego cd

Dwie osoby z historią zdarzeń presynopowych (IV-2 i IV-3) zgodziły się poddać zaprogramowanym stymulacjom elektrycznym. U każdej z tych osób VF indukowano dwoma przedwczesnymi bodźcami z wierzchołka RV. Wszczepiono wszczepiany defibrylator kardiowertera. Po 3 latach obserwacji VF był indukowany w żadnej z trzech osób, u których wykonano programowaną stymulację elektryczną, żaden nie doświadczył zdarzeń sercowych, a funkcja Holtera wszczepialnego defibrylatora kardiowertera nie udokumentowała utrzymujących się arytmii serca. III-14 – bezobjawowy ojcowski kuzyn III-2, którego brat (III-1) zmarł nagle w wieku 55 lat (ryc. 1), wybrany do poddania się analizie genetycznej, ale odmówił oceny klinicznej po zdiagnozowaniu jej jako nosiciela mutacji (ryc. 1). Dla pokrewnych uzyskano wynik lod wynoszący 3,61 przy użyciu markera na locus 3p21,. = 0,01. Wytwarzanie linii komórkowych ekspresjonujących dzikiego typu i zmutowane kanały Na +. Mutacje K1500 z delecją, K1500E, K1500Q i. K1499 z genu kanału Na + NaV 1.5 przeprowadzono stosując rekombinowaną PCR (19). Wierność mutacji została udokumentowana przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Ludzkie zarodkowe komórki nerki (293-EBNA) transfekowano plazmidami pcDNA3.1 / hH1, pcDNA3.1 / hH1aK1500,1499, pcDNA3.1 / hH1K1500E i pcDNA3.1 / hH1K1500Q przy użyciu lipofektaminy. Stabilne linie komórkowe ustalono w komórkach 293-EBNA, stosując higromycynę jako dominujący marker selekcyjny. Zestaw doświadczalny. Prądy całego kanału i pojedynczego kanału Na + mierzono stosując standardowe techniki patch-clamp (20). Komórki poddawano superfuzji za pomocą 130-mM Na + zewnętrznego roztworu do rejestrowania całych komórek. Od 0,5 do 1,5-M. mikropipety wypełniono wewnętrznym roztworem CsCl. Wewnętrzny Cs + blokował endogenne kanały K + w komórkach EBNA HEK-293. W tych warunkach nagrywania, wewnętrzny prąd Na + był jedynym zarejestrowanym prądem jonowym. Komórki poddawano superfuzji za pomocą roztworu potasowo-asparaginianowego dla rejestracji jednokanałowych. Wysoki roztwór K + zmniejszył potencjał membrany do około 0 mV. Potencjały membranowe są podawane jako wartości absolutne (tj. Odniesione do 0 mV). 10 do 20-M. mikropipety wypełniono roztworem zewnętrznym Na +. W okazyjnych łatach obserwowaliśmy zewnętrzne prądy jednokanałowe, które różniły się kinetycznie od kanałów Na +. Próby z taką aktywnością zostały wyłączone z analizy. Rozwiązania. Roztwory stosowane w tych doświadczeniach miały następujące składy (mM): Na + zewnętrzny roztwór: NaCl 130, KCl 4, CaCl2 1, MgCl2 5, HEPES 5, glukoza 5 (pH doprowadzono do 7,4 za pomocą NaOH); Cs + roztwór mikropipeta: CsCl 130, MgCl2 1, MgATP 5, 1,2-bis (aminofenoksy) etano-N, N, N a, N a-tetraoctowy kwas 10, HEPES 10 (pH doprowadzono do 7,2 z CsOH); wysokopotasowy roztwór zewnętrzny: asparaginian potasu 140, KCl 10, MgCl2 2, CaCl2 1, glukoza 5, HEPES 5 (pH doprowadzono do 7,4 za pomocą KOH); Roztwór mikropipetowy Na + do rejestracji jednokanałowych: NaCl 140, KCl 5, MgCl2 2,5, CaCl2 0,5, HEPES 5 (pH doprowadzono do 7,4 za pomocą NaOH). Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w temperaturze pokojowej (20-22 ° C). Techniki nagrywania. Zarejestrowaliśmy prądy całokomórkowe i jednokanałowe przy użyciu wzmacniacza patch-clamp Axopatch-200A (Axon Instruments Inc., Burlingame, California, USA) lub EPC-7 (List Medical, Darmstadt, Niemcy). Końcówkę każdej mikropipety pokryto hydrofobowym elektrometrem. Oporność serii i przejściowy współczynnik wydajności zostały skompensowane przy użyciu standardowych technik. Na początku każdego eksperymentu adekwatność kontroli napięcia była oceniana zgodnie z wcześniejszym opisem (21). Prądy z całych komórek przefiltrowano przy 10 kHz i poddano cyfryzacji przy 20. 40 kHz. Zarejestrowaliśmy prąd jednokanałowy z mikroelektrodami o wysokiej oporności (10 20 20 M.). Aby porównać czasy otwarcia, zmniejszyliśmy potencjał utrzymywania, aby zmniejszyć liczbę zachodzących na siebie zdarzeń (mniej niż cztery) przy potencjale testowym wynoszącym. 20 mV. Eksperymenty obejmujące analizę późnych prądów Na + rejestrowano za pomocą 5- do 10-M. mikroelektrody zwiększające liczbę kanałów w patchu. Potencjał utrzymywania ustalono na poziomie od około 100 do około 80 mV. Dwieście-milisekundowe impulsy testowe zastosowano na A40 i A20 mV. Prądy filtrowano przy częstotliwości 2,5 kHz i cyfryzowano przy 20 kHz. Analiza danych. Próby całokomórkowe i jednokanałowe analizowano za pomocą niestandardowego oprogramowania opracowanego w naszym laboratorium (21, 22). Dostępność napięcia i zależności aktywacja-napięcie pasowały do standardowego równania Boltzmanna: h., M. = / {1 + exp [(V. V1 / 2)] / k}, gdzie h. jest zmienną inaktywacji, m. zmienna aktywacyjna, V potencjał membrany, V1 / 2 potencjał, w którym h. lub m. = 0,5, a k współczynnik nachylenia. Rozwój i powrót do stanu sprawności po inaktywacji pasowały do jednej funkcji wykładniczej: I (t) = I. [1. exp (. t /.)], gdzie I (t) jest prądem w czasie t, I. prąd początkowy lub prąd stały, oraz. stała czasu inaktywacji. Aby zbadać późny komponent prądu całej komórki, nagrania przeprowadzono przy wysokim wzmocnieniu (× 2 do × 5) i t
[podobne: masaż leczniczy kręgosłupa, dieta przyspieszająca metabolizm jadłospis, goździki właściwości lecznicze ]
[przypisy: powiększone węzły chłonne w jamie brzusznej, goździki właściwości lecznicze, mleko w proszku dla dzieci ]