Uszkodzenie DNA jest nową odpowiedzią na subiektywne uszkodzenie indukowane przez C5b-9a dopełniacza w podocytach cd

Podocyty pozostawiono do wzrostu przez 3. 4 dni w celu włączenia 3H-tymidyny do DNA. Po stymulacji za pomocą Ab i C + lub C. surowicy, podocyty inkubowano w pożywce przez 30 minut do 24 godzin, a następnie rozpuszczono stosując bufor do lizy. KCl (12 M) dodano do zlizowanych komórek i inkubowano w temperaturze 65 ° C przez 10 minut, zamrażano przez 5 minut, a następnie odwirowano przy 3200 g w celu oddzielenia wytrąconego DNA chromatyny z uszkodzonego DNA (supernatant). Supernatanty i peletki DNA rozpuszczono w płynie scyntylacyjnym i zliczono w liczniku scyntylacyjnym Beckman 3500. Procent jednoniciowego DNA (ssDNA) obliczono dzieląc zliczenia na minutę w supernatancie przez zliczenia na minutę w supernatancie plus zliczenia na minutę w peletce i mnożąc przez 100. Jednokomórkowy test elektroforezy żelowej. lub zastosowano również test kometowy (Trevigen, Gaithersburg, Maryland, USA). Podocyty zdrapano 2 h po stymulacji dopełniacza, rozcieńczono w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i nałożono na szkiełko mikroskopowe dostarczone w zestawie do analizy komet. Skrawki inkubowano w roztworze do lizy, a następnie roztworem alkalicznym do odsłaniania DNA. Preparaty umieszczono w poziomym pudełku do elektroforezy żelowej i nałożono 27 V przez 10 minut. SSDNA migrowała z dala od jądra i była wizualizowana za pomocą barwnika fluorescencyjnego DNA. Obrazy jąder o charakterystycznym ogonie. uszkodzonego DNA wychwycono w mikroskopie fluorescencyjnym. Liczenie w miejscu AP przeprowadzono stosując zestaw do oceny ilościowej DNA z firmy Dojindo Molecular Technologies Inc. (Gaithersburg, Maryland, USA). DNA wyizolowano ze stymulowanych C5b-9a i kontrolowano podocyty przy użyciu zestawu do izolacji DNeasy (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA). Miejsca AP wykrywano w izolowanym DNA przy użyciu odczynnika reagującego na sacharyd aldehydowy (ARP). Po potraktowaniu DNA odczynnikiem ARP, miejsca AP zaczęto znakować biotyną, a DNA wiązano na płytce do mikromiareczkowania razem ze standardami DNA znakowanymi ARP. Miejsca wizualizowano za pomocą streptawidyny peroksydazowej. Liczbę miejsc AP w próbce DNA określono przez porównanie absorbancji przy 650 nm DNA próbki do krzywej standardowej. In vivo. Test kometowy (patrz powyżej) przeprowadzono na izolowanym kłębuszku w celu określenia, czy uszkodzenie DNA występowało na podocytach in vivo. Test TUNEL i fragmentacja DNA Zastosowanie testu TUNEL opisano wcześniej (18). Zestaw drabiny DNA samobójców (Oncogene Research Products, Boston, Massachusetts, USA) został wykorzystany do określenia, czy charakterystyczna fragmentacja DNA apoptozy wystąpiła w podocytach stymulowanych dopełniaczem in vitro. Promieniowanie UV (5000 mJ) zastosowano jako kontrolę pozytywną. DNA wyekstrahowano, a apoptotyczny DNA oddzielono od chromatyny o wysokiej masie cząsteczkowej, stosując bufor do ekstrakcji. Pofragmentowane DNA wytrącono przy użyciu współstrącacza Pellet Paint, zgodnie z protokołem producenta. Następnie DNA poddano elektroforezie w żelu agarozowym zawierającym bromek etydium (0,5 .g / ml) w temperaturze 50 ° C. Biopsje nerkowe z immunobaraniem utrwalono w roztworze metylowym Carnoya lub w formalinie i zatopiono w parafinie. Aby zapewnić równe wiązanie Ab u szczurów kontrolnych i PHN, przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne i oceniono ilościowo dla owczych IgG i C5b-9 (19). Pośrednie barwienie immunoperoksydazą (20) przeprowadzono na odcinkach 4 urn z użyciem następujących pierwszorzędowych Abp dla inkubacji przez noc: klonu mysiego PAb421 monoklonalnego do mysiego p53, owczego poliklonalnego antyCKK-1, króliczego poliklonalnego antyCKK-2 (Onkogenu Produkty badawcze), królik poliklonalny anty-GADD45 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), klon myszy SX118 monoklonalnych do p21 (Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA). Kontrole obejmowały pominięcie pierwszorzędowego Ab lub zastąpienie pierwszorzędowego Ab surowicą przed immunizacją. Przeprowadzono immunobarwienie p53 na zamrożonych skrawkach metodą pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego. Analiza Western blot Analiza Western blot została przeprowadzona jak opisano uprzednio (12, 19, 21) na białku wyekstrahowanym z hodowanych podocytów myszy i szczura poddanych subtelnemu atakowi C5b-9 oraz z izolowanych kłębków nerki kontrolnej i szczurów PHN. Ekstrakty białkowe (20 .g) rozdzielano w obniżonych warunkach na żelu SDS-PAGE 15%, 12% lub 8%. Błony inkubowano z Ab do p21, p53, CHK-1, CHK-2, GADD45 i ERK-1 i -2 (Cell Signaling Technology, Beverly, Massachusetts, USA). Kontrole obejmowały zastosowanie białka o dodatniej lub ujemnej wartości dla specyficznego białka, które zostało zabarwione lub pominięcie pierwszorzędowego Ab. Aby zapewnić równe ładowanie białek, zastosowano białka Ab do białek metabolicznych tubuliny (RBI, Natick, Massachusetts, USA) lub aktyny (Chemicon International, Temecula, California, USA) i wszędzie tam, gdzie zmierzono białka fosforylowane, całkowita zawartość białka dla tego produktu został również zmierzony. Hamowanie ERK-1 i -2 Ponieważ nasze wyniki wykazały, że ERK-1 i -2 były fosforylowane przez subtelne uszkodzenie C5b-9 (patrz poniżej), w wybranych eksperymentach aktywność ERK-1 i -2 była selektywnie hamowana przy użyciu U0126 (50 . M; Cell Signaling Technology)
[hasła pokrewne: mleko w proszku dla dzieci, najlepsza odzywka do rzes, centermed słoneczna tarnów ]
[patrz też: dieta przyspieszająca metabolizm jadłospis, ciasto marchewkowe wegańskie, powiększone węzły chłonne w jamie brzusznej ]