Uszkodzenie DNA jest nową odpowiedzią na subiektywne uszkodzenie indukowane przez C5b-9a dopełniacza w podocytach ad

Sposoby wytwarzania transgenicznych myszy H-2Kb-tsA58 i izolowania podocytów z nerek H-2Kb-tsA58 opisano wcześniej (13). Gdy te mysie podocyty hoduje się w warunkach zezwalających na wzrost (33 ° C i pożywki uzupełnione 50 | jg / ml mysiego IFN-a), proliferują i utrzymują jednorodną, brukowatą morfologię. W przeciwieństwie do tego, gdy hoduje się je w warunkach różnicujących (37 ° C, brak IFN-y), przestają one proliferować, opracowują złożoną sieć procesów i przyjmują typowo zróżnicowany i postmitotyczny fenotyp. Te ostatnie warunki wykorzystaliśmy do zaprezentowanych tu badań. Komórki mezangialne. Aby określić, czy wpływ subtelnej ekspozycji C5b-9 na uszkodzenie DNA był specyficzny dla podocytów, zbadaliśmy również szczurzą komórki mezangialne (RMC), jak opisano wcześniej (11). Ab-C5b-9 stymulacja komórek in vitro Podocytów. W celu indukowania subtelnego ataku C5b-9, podocyty myszy i szczurów wysiewano na płytki i umożliwiono wzrost do 50% konfluencji. Podocyty podzielono na trzy grupy (6). Grupę uczulano na pożywki zawierające 5 mg / ml owczej IgG przeciw Fx1A (podocyt szczurzy) lub 2 mg / ml owczej przeciw-mysiej IgG podocytów (podocyty myszy) w 37 ° C przez 30 min. Uczulone podocyty następnie eksponowano na subtelną ilość dopełniacza (patrz poniżej) przez 60 minut, przemyto trzy razy, a następnie inkubowano w pożywce wzrostowej. Grupa 2, kontrola komórek zaatakowanych C5b-9a, uczulano IgG i eksponowano na surowicę, która nie miała C6 przez 60 minut (patrz poniżej). Podocyty z grupy 3, kontrola dla AbAs, eksponowano na pożywki w 37 ° C przez 30 minut pod nieobecność podocytów anty-Fx1A lub przeciw-mysich. RMCs. Aby ustalić, czy subtelny atak C5b-9 wywoływał uszkodzenie DNA w innych typach komórek, RMC wysiane w 24-studzienkowej płytce przy gęstości 2 x 105 komórek / cm2 inkubowano z IgG anty-Thy1 (5 mg / ml) w 37 ° C. ° C przez 30 minut (11). Jedną grupę następnie eksponowano na subtelną ilość dopełniacza (surowica PVG C +, patrz poniżej), podczas gdy komórki kontrolne eksponowano na surowicę pozbawioną C6 (surowica PVG C3, patrz poniżej). Odczynniki i warunki subiektywnego ataku C5b-9 Surowica pochodząca od normalnych szczurów Piebald Virol Glaxo (PVG) (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, Indiana, USA) z obecnym funkcjonalnym układem dopełniacza (C +) została użyta jako źródło dopełniacza do indukowania subtelnego C5b -9 atak. Surowicę ze szczurów PVG z niedoborem C6 z funkcjonalnym układem dopełniacza nieobecnym (C.) (Bantin i Kingman Universal, Fremont, Kalifornia, USA) zastosowano jako kontrolę. DO. szczury wykazują całkowity brak C6, odziedziczony w autosomalnym recesywnym schemacie i nie są w stanie złożyć C5b-9 (14). Selekcja stężeń Ab i dopełniacza była oparta na badaniach miareczkowania w szachownicy w celu określenia wymaganych ilości Ab i dopełniacza bez powodowania urazu lub lizy podocytu (zdefiniowanego jako> 5% uwalniania dehydrogenazy mleczanowej, patrz poniżej). Surowicę rozcieńczono do 8% i naniesiono na komórki uczulone za pomocą Ab i inkubowano przez godz. W 37 ° C, aby umożliwić insercję C5b-9. Komórki przemyto pożywką pozbawioną surowicy, aby usunąć niezwiązany dopełniacz. Aby upewnić się, że atak C5b-9 nie indukuje istotnej lizy komórek, dehydrogenazę mleczanową (LDH) mierzono w supernatantach przy użyciu zestawu do oznaczeń toksykologicznych in vitro (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) (15). Lizę wyrażano jako procent zmiany absorbancji pożywki w porównaniu ze zmianami absorbancji komórek poddanych lizie tritonu i pożywki (uwalnianie <5% LDH uważano za subiektywne). Model pasywnego zapalenia nerek Heymanna Aby przetestować hipotezę, że indukowane przez C5b-9 uszkodzenie DNA podocytów in vivo, u samców szczurów Sprague-Dawley (Simonsen Laboratories, Gilroy, California, USA) indukowano pasywny model bolesnej nefropatii Heymanna (PHN) wstrzyknięcie dootrzewnowe (5 ml / kg masy ciała) owcy Ab do Fx1A przygotowano jak opisano wcześniej. Szczury Sprague-Dawley, którym wstrzyknięto normalną surowicę owczą (5 ml / kg masy ciała) służyły jako kontrole przeciwciała anty-Fx1A. Aby potwierdzić, że nasze wyniki rzeczywiście zależą od C5b-9, PHN indukowano również u szczurów PVG C + i w PVG C. szczury. Szczury kontrolne i szczury PHN uśmiercano w 3, 5 i 30 dniu (n = 6 w każdym punkcie czasowym) w przypadku biopsji nerkowych i izolacji kłębuszkowej. Wydzielanie białka w moczu przed uśmierceniem oznaczono u zwierząt kontrolnych i PHN za pomocą metody kwasu sulfosalicylowego (16). Pomiar uszkodzeń DNA in vitro i in vivo In vitro. Zastosowano trzy metody w celu określenia obecności uszkodzenia DNA w stymulowanych dopełniaczem podocytach in vitro. Zastosowano test precypitacji DNA (17), elektroforezę w żelu jednokomórkowym oraz test zliczania miejsc apurinowo-apirymidynowych (AP). Do oznaczenia precypitacji DNA podocyty umieszczano na 24-studzienkowych płytkach z 2 .l 3H-tymidyny na każde ml pożywki. [więcej w: łojotokowe zapalenie skóry głowy wypadanie włosów, trening pod sztuki walki, ciasto marchewkowe wegańskie ] [patrz też: najlepsza odzywka do rzes, masaż leczniczy kręgosłupa, koszt rezonansu magnetycznego ]