Uszkodzenie DNA jest nową odpowiedzią na subiektywne uszkodzenie indukowane przez C5b-9a dopełniacza w podocytach ad 7

Zmierzyliśmy ERK natychmiast (0. 45 min) i później (1. 20 h) po uszczerbku na zdrowiu. Nastąpił dwufazowy wzrost fosforylowanych poziomów ERK w ciągu 15 minut i ponownie po 8 godzinach (Figura 6b). Wzrost nie był spowodowany nierównomiernym obciążeniem białkiem, ponieważ całkowite poziomy ERK-1 i -2 były podobne we wszystkich ścieżkach, podobnie jak białko utrzymujące, aktynę (dane nie pokazane). Rysunek 6ERK reguluje p21 i GADD45 po subtelnym ataku C5b-9. (a) Fosforylowane ERK mierzono za pomocą analizy Western blot na kontrolnych (C.) i zaatakowanych C5b-9. (C +) podocytach i (b) densytometrię stosowano do ilościowego oznaczenia zmian w porównaniu z całkowitymi poziomami ERK. Fosforylowany ERK wzrósł w ciągu 15 minut od subtelnego ataku C5b-9, a to znormalizowało się o godzinę. Następnie nastąpił drugi wzrost fosforylowanej ERK po 8 godzinach. (c) Hamowanie fosfo-ERK z U0126 zmniejszone GADD45 i p21. (d) Hamowanie ERK-1 i -2 przez U0126 wzmaga uszkodzenie DNA wywołane podrzędnym C5b-9 (linia 4) w porównaniu z kontrolami (ścieżka 3). Następnie określiliśmy rolę ERK w odpowiedzi na uszkodzenie DNA indukowane przez C5b-9. Figura 6c pokazuje, że hamowanie ERK za pomocą U0126 w podocytach zaatakowanych przez C5b-9a zmniejszało poziomy białka p21 i GADD45, ale nie p53. Wyniki te pokazują, że ERK reguluje ekspresję p21 i GADD45 po subtelnym wywołanym C5b-9c uszkodzeniu podocytów. Na koniec zapytaliśmy, czy ERK-1 i -2 były krytyczne w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, pod wpływem subtelnego urazu C5b-9, a wyniki pokazano na fig. 6d. W porównaniu z podocytami poddanymi subtelnemu uszkodzeniu indukowanemu C5b-9a, hamowanie ERK-1 i -2 znacząco zwiększało uszkodzenie DNA indukowane przez C5b-9. Badania te pokazują, że ERK-1 i -2 chronią podocyty przed uszkodzeniem DNA indukowanym przez C5b-9 i że ten efekt jest pośredniczony przez p21 i GADD45. Dyskusja Podocyty są celem urazów z udziałem układu odpornościowego w schorzeniach kłębuszkowych, w szczególności nefropatii błoniastej (22). Po subtelnej insercji C5b-9 podocyty zwiększają poziomy czynników wzrostu, cytokin i białek macierzy pozakomórkowej, aktywują specyficzne szlaki sygnałowe i czynniki transkrypcyjne oraz uwalniają proteazy i utleniacze (23). Sublytic C5b-9 indukuje aktywację podocytów in vitro i in vivo, co jest związane z wejściem do cyklu komórkowego i syntezą DNA (choć ograniczone) (6, 19). W odróżnieniu od RMC (24) mitoza i cytokinezy nie są jednak zaznaczone na podocytach po urazie C5b-9 (7, 9, 19). W tym badaniu donosimy o odkryciu, że subtelny C5b-9 powoduje uszkodzenie DNA na podocytach in vitro i in vivo, co jest związane ze wzrostem p53, GADD45, CHK-1 i CHK-2 oraz inhibitorem CDK p21 i tym MAPK, ERK-1 i -2 chroni podocyty przed uszkodzeniem DNA wywołanym przez C5b-9. Wyniki pokazują, że uszkodzenie DNA jest kolejną konsekwencją ekspozycji komórki na subtelną insercję C5b-9 do błon komórkowych. W przeciwieństwie do kłębuszkowych komórek mezangium i śródbłonka, podocyty nie ulegają szybkiej proliferacji w odpowiedzi na uraz z udziałem układu odpornościowego. Ponadto niewystarczająca odpowiedź proliferacyjna podocytów przyczynia się do rozwoju stwardnienia kłębuszków nerkowych (8, 25). Proliferacja jest regulowana na poziomie cyklu komórkowego przez białka regulatorowe cyklu komórkowego (26). Podocyty mają maszynerię jądrową potrzebną do syntezy DNA (19). Jednak subtelny atak C5b-9 na podocyty powoduje opóźnienie / hamowanie w fazie G2 / M (6). Podsumowując, badania te sugerują, że widoczny brak proliferacji podocytów występuje zarówno na poziomie syntezy DNA, jak i mitozy. W związku z tym, celem niniejszego badania było określenie możliwych mechanizmów leżących u podstaw zatrzymania fazy podocytów G2 / M po uszkodzeniu indukowanym C5b-9a. Pierwszym ważnym odkryciem w obecnym badaniu było to, że podjednostkowe indukowane przez C5b-9a uszkodzenie podocytów powoduje uszkodzenie DNA na podocytach in vitro i in vivo. Wyniki były podobne u szczurów i zróżnicowanych postocytotycznych podocytów myszy. W przeciwieństwie do tego subtelny C5b-9 nie powodował uszkodzeń DNA w RMC. Co więcej, uszkodzenie DNA było również znacząco zwiększone na podocytach w modelu PHN błoniastej nefropatii, ale nie u zwierząt kontrolnych, którym wstrzyknięto normalną surowicę owczą. Nasze dane in vitro i in vivo pokazują, że zjawisko uszkodzenia DNA zależy od C5b-9. Jak zostanie to omówione poniżej, nasze wyniki pokazują, że C5b-9 także zwiększa specyficzne geny odpowiedzi na uszkodzenia DNA, dodatkowo potwierdzając pogląd, że nasze odkrycia są specyficzne dla uszkodzenia DNA. W przeciwieństwie do komórek mezangialnych (27), subiektywne uszkodzenie C5b-9 nie indukowało apoptozy w hodowli podocyta szczura i myszy. Jednym z wyjaśnień jest efekt dawki, ponieważ więcej litycznych stężeń C5b-9 mogło indukować apoptozę. Komórki zatrzymują się w cyklu komórkowym, aby mechanizmy naprawy działały po uszkodzeniu DNA
[hasła pokrewne: mleko w proszku dla dzieci, powiększone węzły chłonne w jamie brzusznej, masaż leczniczy kręgosłupa ]
[przypisy: mma core, mmacore, ankos zapasy warszawa ]