Uszkodzenie DNA jest nową odpowiedzią na subiektywne uszkodzenie indukowane przez C5b-9a dopełniacza w podocytach ad 5

Wyniki te pokazują, że subtelna ekspozycja na C5b-9 powoduje uszkodzenie DNA na podocytach myszy i szczura in vitro. Mierzono również uszkodzenia DNA w RMC po subtelnej ekspozycji C5b-9. W przeciwieństwie do podocytów, uszkodzenia DNA nie zostały wykryte w RMC (dane nie pokazane). Jednakże, napromieniowanie UV, stosowane jako kontrola pozytywna, indukowało uszkodzenie DNA w RMC (dane nie pokazane). Podsumowując, wyniki te pokazują, że sub-subtelna ekspozycja na C5b-9 powodowała uszkodzenie DNA specyficznie w podocytach, ale nie w RMC. Sublytic C5b-9 nie indukuje apoptozy w podocytach Wyniki testów TUNEL i prób samobójczych DNA drabinowych stosowanych do pomiaru apoptozy przedstawiono dla podocytów szczura (figura 3, ay) i myszy (figura 3, df). Ekspozycja hodowanych szczurzych i mysich podocytów na Ab bez źródła dopełniacza nie indukowała apoptozy (Figura 3, a i d). Ponadto, Figury 3, b i e pokazują, że eksponowanie podocytów na Ab i źródło dopełniacza nie wiązało się z dodatnim barwieniem TUNEL. Wyniki nie były fałszywie negatywne, ponieważ barwienie TUNEL wzrastało w podocytach narażonych na indukowanie apoptozy dawek promieniowania UV (Figura 3, c i f). Ryc. 3Subtelny C5b-9 nie indukuje apoptozy w podocytach. a. f pokazuje barwienie TUNEL, marker apoptozy. Apoptozy nie wykryto u kontrolnych szczurzych (a) i mysich (d) podocytów eksponowanych na Ab bez źródła dopełniacza, ani w doświadczalnych szczurzych (b) i mysich (e) komórkach eksponowanych na Ab ze źródłem komplementu. Przeciwnie, barwienie TUNEL jest zwiększone na podocytach szczurzych (c) i mysich (f) wystawionych na działanie promieniowania UV, stosowanych jako kontrola pozytywna. Test drabiny DNA samobójców jest pokazany na podocytach szczurzych (g) i mysich (h). W przeciwieństwie do fragmentacji DNA w podocytach poddanych promieniowaniu UV (ścieżki 1, 2, 3), fragmentacja DNA nie została wykryta w komórkach eksponowanych na Ab z (C +) (ścieżki 4, 5, 6) i bez (C.) (Ścieżki 7, 8, 9) źródło komplementarne. Wyniki drabinowania DNA mierzone za pomocą testu drabiny DNA z samobójstwem pokazano na fig. 3. Drabinowania DNA nie wykryto na podocytach szczura (fig. 3g) lub myszy (figura 3h) wystawionych na działanie Ab ze źródłem wspomagającym lub bez niego. Drabinę DNA wykryto jednak w podocytach poddanych promieniowaniu UV, które zastosowano jako kontrolę pozytywną. Podsumowując, testy te wykazują, że subtelne indukowane przez C5b-9a uszkodzenie szczurów i podocytów myszy nie powoduje apoptozy, a raczej powoduje specyficzne uszkodzenie DNA. Subtelna ekspozycja na C5b-9 powoduje również uszkodzenie DNA u szczurów PHN. PHN indukowano w Sprague-Dawley, PVG C + i PVG C. szczury. Immunobarwione IgG owcy było podobne we wszystkich trzech szczepach, którym wstrzyknięto Ab anty Fx1A (wyników nie pokazano). Przeciwnie, barwienie C5b-9 nie zostało wykryte u szczurów Sprague-Dawley, którym wstrzyknięto normalną surowicę owczą, ani w PVG C. szczurom, którym wstrzyknięto Ab anty-Fx1A (wyników nie pokazano). Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano znaczny wzrost białkomoczu u szczurów Sprague-Dawley z PHN (165. 10,4 mg) w porównaniu ze szczurami kontrolnymi Sprague-Dawley (14,6 . 3,2) (P <0,001 względem kontroli). Uszkodzenia DNA in vivo mierzono na szczurach PHN kilkoma metodami. Nie stwierdzono wykrywalnego uszkodzenia kłębuszków DNA u zwierząt kontrolnych (ryc. 2i). Przeciwnie, uszkodzenie DNA było obecne w izolowanych kłębuszkach ze szczurów PHN Sprague-Dawley (Figura 2j). Aby udowodnić, że uszkodzenie DNA było konsekwencją C5b-9, PHN indukowano również w PVG C + i PVG C. szczury. Nasze dane pokazały, że uszkodzenie DNA nie zostało wykryte w kontroli PVG C. zwierzęta, którym wstrzyknięto Ab anty-Fx1A (Figura 2k). Przeciwnie, Figura 2l pokazuje uszkodzenie DNA u szczurów PVG C +, którym wstrzyknięto Ab anty-Fx1A. Podsumowując, dane pokazują, że doświadczalna nefropatia błoniasta jest związana z uszkodzeniem DNA, a było to konsekwencją ataku C5b-9. Poziomy p53 wzrastają in vitro i in vivo po subtelnym ataku C5b-9. Figura 4 pokazuje, że białko p53 wykryto w bardzo małej obfitości u szczurów (Figura 4a) i podocytów kontrolnych myszy (Figura 4b) in vitro wystawionych na działanie Ab bez źródła dopełniacza. Przeciwnie, Figura 4 pokazuje, że eksponowanie podocytów szczura (Figura 4a) i myszy (Figura 4b) na Ab i źródło dopełniacza jest związane z wyraźnym wzrostem poziomów białka p53. Rycina 4 Subtelny C5b-9 zwiększa ekspresję CHK-1, CHK-2, p53, p21 i GADD45 na podocytach in vitro. Analizę Western blot stosowano do pomiaru białek z podocytów szczurzych in vitro (a) i myszy (b) eksponowanych na Ab ze źródłem dopełniacza (C +) i bez źródła dopełniacza (C.). C5b-9 zwiększał poziomy białka całkowitego CHK-1, fosforylowanego (phos) CHK-1, fosforylowanego CHK-2, p53, p21 i GADD45. Białka utrzymujące porządek, aktyna i tubulina wykazały, że ładowanie białka było równoważne. Następnie ustaliliśmy, czy atak C5b-9 również zwiększył p53 in vivo, stosując model PHN [podobne: kimura chwyt, nr na pogotowie ratunkowe, zapytaj trenera ] [podobne: fundacja dzieciom zdążyć z pomocą logowanie, masaż nuru na czym polega, nr na pogotowie ratunkowe ]