Odzyskiwanie z cukrzycy u myszy regeneracja komórek czesc 4

Ponadto, wzór ekspresji czynnika transkrypcyjnego Pdx1, o którym wiadomo, że ulega ekspresji w komórkach progenitorowych zarodkowej trzustki, nie różni się pomiędzy myszami typu dzikiego i transgenicznymi (dodatkowa Figura 6). Poszukiwaliśmy również komórek, które koeksprymują insulinę i inne hormony endokrynologiczne, proponowane przez niektórych do reprezentowania endokrynnych komórek progenitorowych (27). Częstotliwość komórek insulina + / glukagon + wzrosła z 1: 5.500. komórki myszy typu dzikiego do 1: 1000. komórki u myszy z cukrzycą (dodatkowa Figura 6). Jeśli te komórki podwójnie hormonalne są komórkami progenitorowymi lub prekursorami, w przeciwieństwie do ślepych ścieżek (27), ich liczba w tym kontekście wydaje się zbyt niska, aby wnieść znaczny wkład do. regeneracja komórek. Te wyniki wskazują, że zwiększenie samopowielania przetrwania. komórki to najprostsze wytłumaczenie. regeneracja komórek. Niemniej jednak, względne znaczenie. proliferacja komórek a różnicowanie lub transróżnicowanie innych typów komórek jest trudne do odróżnienia od analizy histologicznej i wzorów ekspresji genów. Dlatego wykorzystaliśmy śledzenie linii genetycznych jako rygorystyczny test na komórkowe pochodzenie nowego. komórki w tym modelu. Jak opisano wcześniej (21), wykorzystano transgeniczne myszy Insulin-CreERTM, w których promotor insuliny stymuluje ekspresję zależnej od tamoksyfenu rekombinazą Cre (CreERTM) w. komórki. Aby umożliwić oznaczanie impulsów zróżnicowanych. komórki, połączyliśmy ten szczep ze szczepem reporterowym Z / AP Cre (21) w celu wytworzenia myszy Insulin-CreERTM; Z / AP. Wstrzyknięcie tamoksyfenu do takich myszy prowadzi do przejściowej aktywacji rekombinazy Cre wyłącznie w komórkach wyrażających insulinę. Powoduje to usunięcie transkrypcyjnej sekwencji stop z transgenu Z / AP i konstytutywną ekspresję ludzkiego genu reporterowego fosfatazy zasadowej ludzkiej (HPAP) w. komórki i ich potomstwo (Figura 4A). Tak więc wyrażenie HPAP w. komórki urodzone w dowolnym momencie po wstrzyknięciu tamoksyfenu identyfikują te komórki jako potomstwo wcześniej istniejących komórek eksprymujących Cre. Hodowaliśmy transgeniczne myszy złożone zawierające zarówno system ablacji (Insulina-rtTA; TET-DTA), jak i system śledzenia linii (Insulin-CreERTM; Z / AP). Aby zidentyfikować źródło nowego. komórki podczas regeneracji,. komórki poddano ablacji przez traktowanie nowonarodzonych myszy doksycykliną przez 45 dni, co spowodowało cukrzycę. Czy w ciągu ostatnich 10 dni leczenia doksycykliną (wiek 35. 45 dni) przeżyło. komórki znakowano serią 5 iniekcji tamoksyfenu, po czym pobierano doksycyklinę w celu umożliwienia regeneracji. W trakcie regeneracji myszy otrzymały BrdU w wodzie pitnej, aby oznaczyć nowe. komórki powstałe w wyniku replikacji z dowolnego źródła komórkowego (Figura 4A). Po 2 tygodniach myszy uśmiercono, a udział HPAP +. komórki pośród wszystkich. komórki i nowe (np. BrdU +). komórki zostały określone. Jak pokazano na rysunku 4B, niższy odsetek komórek HPAP + wśród nowych. komórki wskazują, że nie. komórki przyczyniają się do. regeneracja komórek. Figura 4C pokazuje reprezentatywny obraz konfokalny wysepki barwionej na insulinę, HPAP i BrdU. Zauważ, że tylko około 20%. komórki były znakowane przez HPAP (w wyniku aktywności Cre), z powodu nieskuteczności indukowanej przez tamoksyfen rekombinacji za pośrednictwem Cre. Należy podkreślić, że ta stopa rekombinacji wystarcza, aby dostarczyć informacji, ponieważ dla tej analizy stosunek komórek HPAP + do wszystkich. komórki do tego w nowym. komórki to kluczowy parametr. Rysunek 4Nowy. komórki pochodzą głównie z preegzystencji. komórki. (A) System śledzenia pochodzenia genetycznego, stosowany w połączeniu z systemem ablacji, w celu określenia pochodzenia komórkowego nowego. komórki. Protokół eksperymentalny dla eksperymentu z linią ablacji został przedstawiony poniżej. Tam, tamoksyfen. (B) Projekt eksperymentu i możliwe interpretacje wyników śledzenia linii. Dla uproszczenia. wskaźnik rekombinacji komórek (oznaczanie komórek za pomocą ekspresji HPAP) jest przedstawiony jako 100%, a tempo nowości. akumulacja komórek jako 25%. (C) Reprezentatywny obraz konfokalny wysepki z 2-miesięcznej insuliny-rtTA, TET-DTA, insuliny-CreertM; myszy transgenicznej Z / AP eksponowanej na doksycyklinę w celu ablacji. komórki, wstrzyknięte tamoksyfenem, aby oznaczyć przetrwanie. komórki i traktowano BrdU przez 2 tygodnie w celu znakowania nowych komórek, jak pokazano w A. Strzałki oznaczają HPAP + BrdU +. komórki, potomstwo przetrwania i proliferacji. komórki; groty strzały zaznacz HPAP. BrdU +. komórki, pochodzące z innych niż. komórki lub bez etykiety. komórki. Ponieważ szczepy Insulin-rtTA i Insulin-CreERTM są odrębnymi transgenami, ich skuteczność wynosi. zabijanie komórek i rekombinacja, odpowiednio, nie powinny być identyczne
[przypisy: czarna porzeczka odmiany, koszt rezonansu magnetycznego, kimura chwyt ]
[więcej w: mmacore, ankos zapasy warszawa, trening pod sztuki walki ]