Odzyskiwanie z cukrzycy u myszy regeneracja komórek ad 8

Zmiana składnika immunosupresji w protokole Edmonton może znacznie wydłużyć przeżycie i funkcję przeszczepu. Metody Myszy. Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Hebrajskim. Transgeniczne myszy genotypowano za pomocą PCR na punktach usznych stosując następujące startery: TET-DTA (25), 5a-TTTTGACCTCCATAGAAGAC-3. i 5a-GGCATTATCCACTTTTAGTGC-3; Insulina-rtTA (23), 5a-TAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCG-3. i 5a-GAGATCGAGCAGGCCCTCGATGGTAG-3 .; Insulina-CreERTM (21), 5a-TGCCACGACCAAGTGACAGC-3. i 5a-CCAGGTTACGGATATAGTTCATG-3 .. Myszy Z / AP (55) zidentyfikowano przez wykonanie barwienia X-gal na biopsjach ogona. Doksycyklinę (Dexon) podawano w wodzie do picia (200 .g / ml doksycykliny, 2% w / v sacharozy). Woda była zmieniana co 5 dni. W naszym rutynowym protokole 4-tygodniowe myszy leczono doksycykliną przez 7 dni, a następnie uśmiercono lub pozwolono im odzyskać, przy braku doksycykliny, przez 5. 7 miesięcy. W niektórych doświadczeniach myszy otrzymywały doksycyklinę (przez wodę pitną matki) od urodzenia do 4 tygodnia życia (ryc. 5), od urodzenia do 5 tygodnia życia (dodatkowa rycina 2) lub od urodzenia do 45 dnia życia ( Rysunek 4). Tamoksyfen (Sigma-Aldrich) rozpuszczono w oleju kukurydzianym do 20 mg / ml i wstrzykiwano podskórnie przez 10 dni w 5 dawkach po 8 mg każda. Testy tolerancji glukozy przeprowadzono przez wstrzyknięcie glukozy (2 mg / kg) dootrzewnowo po całonocnym głodzeniu. Wrażliwość na insulinę określono przez wstrzyknięcie insuliny (Humalog, 0,75 U / kg, Eli Lilly). W przypadku eksperymentów SirTac przeprowadziliśmy wcześniejsze badania, które dostosowały ludzki protokół do myszy (32). W skrócie, Rapamune (LC Laboratories) załadowano w dawce 0,3 mg / kg w dniu 1, a następnie 0,15 mg / kg co drugi dzień aż do dnia 26, a następnie zmniejszono do 0,1 mg / kg dla następnego obciążenia. Tacrolimus (Prograf; Astellas) wstrzykiwano codziennie w dawce mg / kg. BrdU (Sigma-Aldrich) wstrzykiwano dootrzewnowo (100 mg / kg) na 3 godziny przed uśmierceniem lub podawano w wodzie do picia (0,8 mg / ml). Woda była zmieniana co 5 dni. Analiza. Skrawki parafiny (o grubości 5 .m) ponownie uwodniono, a odzysk antygenu przeprowadzono za pomocą szybkowaru PickCell. Zastosowano następujące przeciwciała pierwotne: anty-insulinę świnki morskiej (1: 200; DAKO), królicze anty-glukagon (1: 200; DAKO), królicze anty-somatostatynę (1: 200, Zymed), królicze polipeptyd przeciw trzustki ( 1: 200, Zymed), mysie anty-BrdU (zestaw do proliferacji komórek, 1: 300, Amersham), królicze anty-ki67 (1: 200, markery Neo), mysie przeciwciało anty-E (1: 50; BD), króliczego anty-HPAP (1: 100, Zymed), świnki morskiej anty-Pdx1 (1: 2500, hojny dar Chrisa Wrighta), mysiego anty-Ngn3 (1: 2000, hojny dar Ole Madsen, Beta Cell Biology Consortium ) i szczurzy anty-F4 / 80 (1:50; Serotec). W przypadku barwnika kontrastowego DNA stosowano jodek propidyny (2 .g / ml) lub Toto3 (1: 500, Molecular Probes). Barwienie TUNEL przeprowadzono przy użyciu zestawu do wykrywania śmierci komórek Roche. Wtórne przeciwciała pochodziły z Jackson Immunoresearch Laboratories. Do podwójnego barwienia wykorzystano tylko wtórne przeciwciała oczyszczone przez powinowactwo, odpowiednie do wielokrotnego znakowania. Jako alternatywną metodę wykrywania komórek HPAP + zastosowaliśmy chromogenny substrat BCIP / NBT alkalicznej fosfatazy jak opisano powyżej (21). Wszystkie obrazy immunofluorescencji zostały przechwycone na mikroskopie konfokalnym Nikon C1. Określić . masa komórek, kolejne sekcje parafiny, w odległości 75. m od całej trzustki (około 9 przekrojów / trzustka) wybarwiono na obecność insuliny i hematoksyliny. Cyfrowe obrazy przekrojów o powiększeniu x 40 otrzymano i zszyto przy użyciu oprogramowania NIS-Elements, i określono frakcję tkanki pokrytej barwieniem insuliny. Masa. komórki obliczono jako iloczyn masy trzustki i frakcji tkanki objętej. komórki. Eksperymenty kontrolne wykazały, że zmienność osobnicza w. masa komórek (znormalizowana do masy ciała) wynosiła około 10% u myszy C57BL / 6 i 25% u myszy ICR (dodatkowa Figura 4F). Poziomy insuliny w trzustce i surowicy określono przy użyciu ultra wrażliwego zestawu ELISA do insuliny (Chrystal Chem). Stopień organizacji wysepek określono ilościowo przez zastosowanie algorytmu MATLAB do cyfrowych obrazów fluorescencyjnych wysepek barwionych pod kątem insuliny i glukagonu. Pokrótce, algorytm określa prawdopodobieństwo, że rozkład przestrzenny glukagonu + komórek w obrębie wysepki jest losowy. Bardziej ograniczony. komórki znajdują się na obrzeżu wysepki, tym mniejsze prawdopodobieństwo, że ta wysepka jest losową mieszanką komórek endokrynnych. RNA przygotowano z całej dorosłej trzustki przy użyciu zestawu Qiagen RNEasy. W celu określenia poziomów Ngn3 znormalizowanych do mTBP zastosowano analizę Taqmana. Statystyka Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu dwustronnego testu Student. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Dane są przedstawione jako średnie. SD. Materiały uzupełniające Zobacz dodatkowe dane Podziękowania Dziękujemy Massimo Trucco i Decio Eizirik za stymulujące dyskusje i Glenn Fishman, Ron DePinho, Gerhard Christofori, Andras Nagy, Chris Wright i Ole Madsen za udostępnienie myszy i przeciwciał. Jesteśmy wdzięczni Tommy emu Kaplanowi, Oldze Martinez, Shay Porat, Alonowi Rasuli, Miri Stolovich-Rain, Avitalowi Swisie i Bat-Sheva Werman za pomoc w różnych eksperymentalnych procedurach i Jayowi Rajagopalowi, Howardowi Cedarowi, Ittai Ben-Porathowi i Benowi Stanger do krytycznego odczytywania manuskryptu. Prace te były wspierane przez konsorcjum Beta Cell Biology (Y. Dor i DA Melton) oraz dotacje z Juvenile Diabetes Research Foundation, Israel Science Foundation, D-Cure i konsorcjum EU BetaCellTherapy (Y. Dor). DA Melton jest badaczem Instytutu Medycznego Howarda Hughesa. Przypisy Niestandardowe skróty: DTA, toksyna błonicy A; HPAP, fosfataza alkaliczna z ludzkiego łożyska; SirTac, Sirolimus i takrolimus. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.117: 2553. 2561 (2007). doi: 10.1172 / JCI32959 Zobacz powiązany artykuł na stronie. Transplantacja komórek i immunosupresja: nie mogą z nią żyć, nie mogą żyć bez niej.
[przypisy: powiększone węzły chłonne w jamie brzusznej, koszt rezonansu magnetycznego, centermed słoneczna tarnów ]
[przypisy: goździki właściwości lecznicze, mleko w proszku dla dzieci, centermed słoneczna tarnów ]