Miejsce i mechanizm działania leptyny w postaci gryzoni wrodzonej lipodystrofii ad

Genotypy określono za pomocą genomowego PCR i Southern blotting. Wszystkie zwierzęta trzymano w 12-godzinnym cyklu światło / ciemność w 23 ° C z wolnym dostępem do wody i pożywienia. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi Laboratorium Badawczego Zwierząt Uniwersytetu Rockefellera. Testy i procedury metaboliczne. Po uśmierceniu myszy, krew zebrano w probówkach zawierających EDTA, a osocze uzyskano po odwirowaniu krwi. Mierzyliśmy poziomy leptyny i insuliny w osoczu za pomocą mysich zestawów ELISA (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA i ALPCO Diagnostics, Windham, New Hampshire, USA, odpowiednio). Oznaczono poziomy glukozy, triglicerydów i cholesterolu w osoczu odpowiednio za pomocą odczynnika Glucose Trinder, odczynnika Triglicerydy Infinity i odczynnika Infinity Cholesterol (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Dokonaliśmy pomiaru trójglicerydów wątrobowych, jak opisano wcześniej (19). Histologię przeprowadzono na wątróbach utrwalonych w 10% formalinie i barwionych H & E. Leczenie leptyny międzykomórkowej. Myszy badano między 14 a 18 tygodniem życia. Dwa tygodnie przed leczeniem leptyną myszy były pojedynczo umieszczane w klatkach. Masę linii podstawowej i pobranie pokarmu mierzono co drugi dzień w cyklu średnio-lekkim. Na początku leczenia myszy podzielono na dwie grupy o dopasowanym ciężarze. Jedną grupę traktowano 12 ng / h rekombinowanej myszy leptyny (Amgen Inc., Thousand Oaks, California, USA), a drugą traktowano PBS przez 12 dni. Myszy znieczulono ketaminą i ksylazyną, a kaniulę podłączoną do pompy miniosmotycznej ALZET (ALZA Corp., Palo Alto, California, USA) umieszczono w trzeciej komorze, jak opisano wcześniej (20). W trakcie leczenia codziennie przyjmowano pokarm i masę ciała, a w dniu 12 myszy uśmiercono w trakcie cyklu średnio świecącego. Podskórne leczenie leptyną. Myszy aP2-nSREBP-1c traktowano 12 ng / h, 25 ng / h, 50 ng / h, 100 ng / h i 200 ng / h rekombinowanej myszy leptyny lub PBS przez 12 dni, stosując podskórnie umieszczone miniosmotyczne pompy ALZET, jak opisano wcześniej (20). Pobranie i masę karmy monitorowano jak opisano powyżej. Mikromacierze. RNA wyizolowany z czterech pojedynczych próbek wątroby połączono, wyznakowano i hybrydyzowano jeden raz do układów Affymetrix Murine Genome U74Av2 zgodnie z protokołami Affymetrix (Affymetrix Inc., Santa Clara, California, USA). W konkretnych przypadkach wyniki Affymetrix zostały potwierdzone za pomocą testu PCR w czasie rzeczywistym TaąMan. Wstępną analizę i porównania przeprowadzono przy użyciu wartości przesunięcia fałdowania wynoszącej 1,5, wartości P zmiany mniejszej niż 0,0025 i wartości wykrywalnej P wynoszącej 0,05 w eksperymencie lub linii podstawowej, w zależności od znaku krotności zmiany. Analiza skupień i korelacji. Analiza klastrów została przeprowadzona przy użyciu standardowego hierarchicznego grupowania z metodą średnich połączeń. Miarą odległości było (1. P) / 2, gdzie p jest funkcją korelacji Pearsona (patrz: Dodatkowe metody dla pełnego opisu analizy korelacji; http://www.jci.org/cgi/content/full/113/ 3/414 / DC1). Aktywność enzymatyczna SCD. Konwersję [1-14C] stearoilo-CoA do oleinianu [1-14C] zastosowano do pomiaru aktywności enzymu SCD z poszczególnych ekstraktów wątroby, jak opisano wcześniej (19). TaqMan. Poziomy mRNA dla SCD-1 oznaczano ilościowo przy użyciu TaqMan PCR w czasie rzeczywistym z poszczególnych wątrób z sondami i starterami zaprojektowanymi dla SCD-1. Poziomy RNA SCD-1 mierzono w dwóch powtórzeniach u myszy a2-nSREBP-1c, myszy z miotami WT i myszy aP2-nSREBP-1c traktowanych ICV leptyną, icv PBS i kilkoma dawkami obwodowej leptyny. Sondę cyklofilinową i startery użyto do ilościowego oznaczenia poziomów mRNA cyklofiliny jako kontroli dla każdej próbki. Analiza kwasów tłuszczowych. Całkowite lipidy ekstrahowano z tkanek zgodnie z metodą Bligh i Dyer, jak opisano wcześniej (21). Kwasy tłuszczowe oznaczono ilościowo metodą chromatografii gazowej, jak opisano wcześniej (22). Kwas pentadekanowy (Sigma-Aldrich) został dodany jako wewnętrzny standard oznaczania ilościowego kwasów tłuszczowych. Ekstrakcja i pomiar aktywności karboksylazy acetylo-CoA. Wyizolowanie karboksylazy acetylo-CoA (ACC) przeprowadzono jak opisano wcześniej (23). Aktywność ACC w frakcji 6% glikolu polietylenowego 8000 określono przy użyciu testu wiązania wodorowęglanu [14C] (24). Oznaczanie zawartości malonylo-CoA. Poziomy malonylo-CoA w wątrobie były mierzone przy użyciu wysoko oczyszczonej syntetazy kwasów tłuszczowych, jak opisano wcześniej (25). Stymulacja insuliny in vivo i analiza białek sygnalizujących insulinę. Samce myszy aP2-nSREBP-1c traktowano przez 12 dni 50 ng / h podskórnej leptyny lub PBS. W dniu 12 myszy znieczulono pentobarbitalem po całonocnym poście i wstrzyknięto 5 jednostek zwykłej ludzkiej insuliny (Lilly Research Laboratories, Indianapolis, Indiana, USA) do dolnej żyły głównej dolnej
[przypisy: zapytaj trenera, najlepsza odzywka do rzes, ankos zapasy warszawa ]
[więcej w: ciasto marchewkowe wegańskie, powiększone węzły chłonne w jamie brzusznej, goździki właściwości lecznicze ]