Indukcja inhibitora Cdk p21 przez LY83583 hamuje proliferację komórek nowotworowych w sposób niezależny od p53 czesc 4

Wstępne HDF, które zostały zatrzymane w fazie G1 przez konfluencję przy podwojeniu populacji 12, zostały użyte jako odniesienie. mRNA wyizolowano 48 godzin po konfluencji HDF i ponad 95% komórek znajdowało się w fazie G1, jak określono za pomocą cytometrii przepływowej (dane nie przedstawione). Ten stan został wybrany w celu uniknięcia porównania nieproliferującego starzenia się HDF z proliferacją HDF we wczesnym okresie, co prawdopodobnie doprowadziłoby do wykrycia dużej liczby różnic w ekspresji genów wtórnych do zatrzymania wzrostu. Kilka genów wcześniej zidentyfikowanych jako konsekwentnie podwyższone lub obniżone podczas starzenia się HDF (19. 21) wykryto jako regulowane w podobny sposób w systemie stosowanym tutaj (Tabela 1): na przykład wcześniej wykryto PAI-1 jako podwyższone w starzejącym się HDF i w tym badaniu indukowano 5,9-krotnie w starzejących się HDF (Tabela 1). Wśród genów represjonowanych podczas starzenia były cztery geny kodujące enzymatyczne komponenty szlaku cGMP (tabela 2): rozpuszczalna cyklaza guanylanowa 3 (sGC-a3), sGC-a3 i zależna od cGMP kinaza białkowa I i II. Różnicowa regulacja sGC-A3 i sGC-A3 podczas starzenia została potwierdzona przez qPCR (Tabela 2). Obniżenie poziomu sGC-A3 podczas starzenia również wykryto stosując analizę Northern blot (Figura 1b). sGC-y3 i sGC-A3 reprezentują dużą i małą podjednostkę rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej, która przekształca GTP w 3-5cykliczny GMP i pirofosforan (22). Interesujące jest to, że oba geny znajdują się w bliskiej odległości na chromosomie 4q31.3-q33 (23), co może stanowić podstawę omawianej tu koregulacji. Figura 1Modulacja szlaku cGMP w HDF i efekty LY. (a) Przedstawiono porównanie HDF po osiągnięciu starzenia się replikacyjnego z HDF po leczeniu LY. Lewy panel pokazuje morfologię (powiększenie, x 100), a prawy panel pokazuje detekcję SA – (3 – gal przy pH 6 (powiększenie, x 200) przy użyciu mikroskopu z kontrastem fazowym. (b) Analiza Northern błot ekspresji GUCY1B3 w HDF. Całkowity RNA wyizolowano z wczesnych (a9. (3) i późnych pasaży (a32. (3) HDF i HDF (a9 pasażowania a) traktowanych 1. M LY przez 4 dni; Na każdą ścieżkę załadowano 2,5 .g całkowitego RNA. GUCY1B3 i, jako kontrola, ELF1. mRNA wykrywano znakowanymi 32P sondami. (c) Odpowiedź wczesnych pasaży i starzenia się HDF na aktywację syntezy cGMP. Komórki traktowano 100. M SNP przez 2 godziny pod nieobecność lub obecność LY. Poziomy cGMP określono w sposób opisany w Metodach. Terapie przeprowadzono w trzech powtórzeniach i zmierzono dwukrotnie. (d) Hamowanie proliferacji przez LY. Subkonfluentne HDF traktowano wskazanymi stężeniami LY przez 3 dni. Liczby komórek określono w trzech powtórzeniach. (e) Nieodwracalne działanie LY na proliferację HDF. Komórki traktowano 1. M LY we wskazanych okresach. Po trypsynizacji liczby komórek określono w trzech powtórzeniach. (f) Analiza FACS HDF traktowanych LY. HDF synchronizowano przez konfluencję i uwalniano przez trypsynizację. Po 24 i 36 godzinach inkubacji w pożywce zawierającej .M LY lub nośnik, komórki zebrano do analizy FACS. Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Metody. (g) Szybkość syntezy DNA po obróbce LY. Inkorporację BrdU określono po inkubacji HDF w 10. M BrdU przez 6 godzin. Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Metody. Tabela Wykrywanie specyficznej dla senescencji regulacji genów za pomocą analizy mikromacierzy. Tabela 2Represja genów kodujących komponenty szlaku sygnałowego cGMP Indukowanie starzenia przez LY. Skoordynowana represja dwóch genów kodujących podjednostki rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej, która generuje cGMP w odpowiedzi na sygnały. na przykład pozakomórkowy tlenek azotu (NO) (recenzja w 24). zasugerował, że starzejące się komórki mogą mieć osłabioną odpowiedź na dawców NO, takich jak SNP. Rzeczywiście, ekspozycja na SNP nie powodowała podwyższonych poziomów cGMP w starzejących się HDF, podczas gdy wczesne pasma HDF wykazały trzykrotny wzrost poziomów cGMP po dodaniu SNP (Figura 1c). W celu swoistego zahamowania szlaku sygnałowego cGMP zastosowano konkurencyjny inhibitor rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej LY o wartości IC50 wynoszącej 2 .M (25). Dodanie 1. M LY do HDF znacząco zahamowało indukowaną przez SNP syntezę cGMP o 50% (Figura 1c), pokazując, że LY ma oczekiwany efekt hamujący na cyklaze guanylanowej. Następnie zapytaliśmy, czy dodanie LY wpłynie na proliferację HDF we wczesnym okresie, jak można się było spodziewać zgodnie z naszą roboczą hipotezą. Efekt LY testowano w stężeniach w zakresie od 0,25 1.5 1,5 M M (rysunek 1d). Rzeczywiście, traktowanie fibroblastów o wczesnym pasażu o stężeniu 1. M LY było wystarczające do całkowitego zahamowania proliferacji, a obecność 250 nM LY doprowadziła do 50% zmniejszenia proliferacji HDF po 3 dniach (Figura 1d).
[przypisy: koszt rezonansu magnetycznego, nr na pogotowie ratunkowe, najlepsza odzywka do rzes ]
[patrz też: kimura chwyt, łojotokowe zapalenie skóry głowy wypadanie włosów, najlepsza odzywka do rzes ]