Indukcja inhibitora Cdk p21 przez LY83583 hamuje proliferację komórek nowotworowych w sposób niezależny od p53 cd

W każdym teście analizowano x 104 komórek. Test proliferacji. Komórki wysiano w równych ilościach na 6-studzienkowych płytkach 24 godziny przed dodaniem LY. Komórki traktowano w trzech powtórzeniach (3 repliki tego samego eksperymentu) codzienną wymianą podłoża zawierającego lek lub lek bez leku. Dla każdego punktu czasowego komórki były trypsynizowane, a proliferację komórek oceniano za pomocą licznika Z1 Coulter (Coulter Electronics, Beds, United Kingdom). Test cGMP. Komórki wczesnych i późnych pasaży wysiano w równych ilościach w sześciostudzienkowych płytkach. Dwadzieścia cztery godziny później dodano stężenie nitroprusydku sodu (SNP, Sigma-Aldrich) w kompletnej pożywce o końcowym stężeniu 100 .M. Kontrole otrzymały taką samą objętość pożywki bez leku. Po 2 godzinach inkubacji pożywkę usunięto i komórki poddano lizie przez dodanie 400 ul 0,1 M HCl na studzienkę przez 10 minut. Stężenie cGMP w lizatach oznaczono stosując kompetycyjny test immunologiczny zgodnie z instrukcjami producenta (Sigma-Aldrich). Do wykrycia sygnału przy 405 nm zastosowano czytnik płytek LAMBDA E (MWG-Biotech AG, Ebersberg, Niemcy). Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach, przy czym wszystkie próbki zmierzono dwukrotnie. Barwienie .-galaktozydazą związane z secesją. Komórki utrwalono przez inkubację w 0,5% aldehydem glutarowym w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wybarwiono dla związanej ze starzeniem P-galaktozydazy (SA-a-gal) przy pH 6,0, jak opisano (17). Wykrywanie syntezy DNA. Komórki wysiewano na szkiełka szklane CELLocate (Eppendorf) i znakowano przez 6 godzin przy użyciu zestawu do oznaczania i wykrywania I (3-bromo-2 (3-deoksyurydyny (Roche Diagnostics GmbH). Po barwieniu znakowanym FITC przeciwciałem anty-bromodeoksyurydynowym (anty-BrdU) wykryto komórki dodatnie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Analiza Western blot. Komórki poddano lizie w 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, mM EGTA, 10% glicerolu, 1% Triton X-100, 100 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, | 3M PMSF i uM Na3VO4 ( wszystkie chemikalia z Sigma-Aldrich). Stężenie białka określono przy użyciu testu Bradforda (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA). Dwadzieścia mikrogramów białka rozcieńczono w buforze Laemmli, rozdzielono na żelu poliakryloamidowym SDS i przeniesiono na membrany Immobilon-P (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA). Przeciwciała przeciwko p53 (Pab 1801), p21 (c-19), p16 (c-20) i a-tubulinie (TU-02) pochodziły z Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Kalifornia, USA). Przeciwciała anty-pRB (G3-245) pochodziły z BD Pharmingen. Zwiększoną chemiluminescencję generowaną przez sprzężone z peroksydazą chrzanową drugorzędowe przeciwciała wykrywano za pomocą Image Station 440CF (Eastman Kodak Co., New Haven, Connecticut, USA). Test lucyferazy. Komórki HCT116 kotransfekowano pWWW-Luc (18) i pCMVa-galaktozydazą (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, Kalifornia, USA) w trzech powtórzeniach, stosując odczynnik Lipofectamine (Invitrogen Corp.). Po 24 godzinach komórki eksponowano na 1,5. M LY lub równą objętość DMSO przez 12 godzin. Aktywność lucyferazy mierzono zgodnie z instrukcjami producenta (zestaw Luciferase Assay System, Promega Corp.). Aktywność .-galaktozydazy mierzono w tych samych lizatach, stosując odczynniki Galacto-Light (Tropix, Bedford, Massachusetts, USA). Oznaczenie lucyferazy i p-galaktozydazy przeprowadzono na luminometrze MicroLumatPlus LB96V (EG & G Berthold, Bad Wildbad, Niemcy). Mikroskopia. Do kontrastu fazowego i barwienia p-galaktozydaz wykorzystano mikroskop Axiovert 25 (Carl Zeiss Co., Oberkochen, Niemcy) wyposażony w kamerę HyperHAD CCD (Sony, Tokio, Japonia) i oprogramowanie ImageBase (Kappa Optoelectronics GmbH, Gleichen, Niemcy). . Ekspresję in vivo białka zielonej fluorescencji wzmocnionego histonem-H2B (histon-H2B-eGFP) udokumentowano na odwróconym mikroskopie Axiovert 200M (Carl Zeiss Co.) wyposażonym w kamerę CCD (CoolSNAP-HQ, Photometrics, Tucson, Arizona, USA). ) i oprogramowania Metamorph (Universal Imaging Corp., Downingtown, Pennsylvania, USA). Wyniki Analiza mikromacierzy ekspresji genów specyficznych dla senescencji. Wykorzystaliśmy analizę mikromacierzy do identyfikacji genów i ścieżek zaangażowanych w indukcję i utrzymanie replikacyjnego starzenia się. Pierwotne HDF hodowano do momentu, aż proliferacja wszystkich komórek ustała z powodu replikacyjnego starzenia (podwojenie populacji u ludzi). W tym momencie HDF wykazywały charakterystyczne oznaki starzenia: powiększenie komórkowe, barwienie SA-A-gal przy pH 6 (Figura 1a), i zatrzymanie terminalne w obecności wysokiego stężenia w surowicy (głównie w fazie G1 określonej za pomocą cytometrii przepływowej). ) (dane nie pokazane). mRNA wyizolowano ze starzejących się HDF i poddano analizie za pomocą mikromacierzy, która pozwala wykryć 8392 cDNA z adnotacjami (szczegóły, patrz Metody).
[więcej w: dieta przyspieszająca metabolizm jadłospis, techniki mma, masaż nuru na czym polega ]
[przypisy: ankos zapasy warszawa, trening pod sztuki walki, techniki mma ]