Indukcja inhibitora Cdk p21 przez LY83583 hamuje proliferację komórek nowotworowych w sposób niezależny od p53 ad

Hamowanie takiego enzymu przez małą, przepuszczalną dla błony cząsteczkę leku we wczesnych pasażach lub komórkach nowotworowych powinno teoretycznie być wystarczające do indukowania komórkowego starzenia się. W celu wykrycia genów i szlaków represjonowanych podczas starzenia się replikacyjnego, wzór ekspresji genu starzejących się HDF porównywano z sygnaturą ekspresji zlewających się komórek wczesnego pasażowania. W ten sposób zidentyfikowaliśmy substancję farmakologiczną indukującą starzenie się komórek. Metody Hodowla komórek i leczenie lekami. Skrawki HDF noworodków otrzymano z Clonetics (San Diego, Kalifornia, USA) i hodowano w DMEM (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA) uzupełnionym 10% FBS (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). W celu uzyskania starzejących się HDF komórki rozcieńczano co 3 dni w stosunku 1:10 (równym pasażowaniu), aż przestały się rozmnażać. Komórki HCT116 hodowano w pożywce McCoya (Invitrogen Corp.) uzupełnionej 10% FBS. A-375, HeLa, HEK293, p16. /. zarodkowe fibroblasty myszy (MEF) i pochodne NIH3T3-L1 trzymano w DMEM zawierającym 10% FBS. 6-Anilino-5,8-chinolinodion (LY83583, określany dalej jako LY, Calbiochem, San Diego, Kalifornia, USA) rozpuszczono w DMSO (Sigma-Aldrich) w stężeniu 300 .M (300 x roztwór). Jako kontrolę komórki traktowano równymi objętościami DMSO (<1%). Koncentrację LY przywracano w odstępach 24-godzinnych za pomocą wymiany mediów. Analiza mikromacierzy ekspresji genów. RNA izolowano przy użyciu odczynników RNAgents (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Po wyizolowaniu mRNA, integralność i wzbogacanie zapewniono stosując analizę Northern blot. Sześćset nanogramów mRNA poli-A przekształcono w cDNA z włączeniem trifosforanów deoksynukleotydu (dNTP) znakowanych Cy3 lub Cy5. Hybrydyzacja do macierzy powlekanych szkłem, kontrola jakości i normalizacja zostały wykonane przez IncyteGenomics (Palo Alto, Kalifornia, USA). The. Human Unigene 1. tablica zawierała sondy cDNA reprezentujące 8 392 annotowane geny / wyrażone znaczniki sekwencji (EST) i 74 niezannotowane geny / EST. Analiza Northern blot. RNA wyizolowano przy użyciu zestawu RNAgents. Północna sonda skierowana przeciw nieutłumaczonemu regionowi 3. Czynnika wydłużania 1. MRNA (ELF1a) wytworzono metodą PCR, stosując EST jako matrycę, a następnie oczyszczając żel. W przypadku p21 zastosowano sondę odpowiadającą otwartej ramce odczytu p21. Sonda odpowiadająca 5. region rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej 3 (sGC-a3) zamplifikowano z cDNA HDF, potwierdzono przez sekwencjonowanie i subklonowano. Hybrydyzacje przeprowadzono w QuickHyb zgodnie z instrukcjami producenta (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) przeprowadzono przy użyciu zestawu LightCycler i zestawu FastStart DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy), jak opisano wcześniej (15). W przypadku qPCR cDNA zaprojektowano pary primerów do generowania pasm intronowych o wielkości 100. 200 bp. Sekwencje starterów były następujące: GUCY1A3, sens 5 (3 -TTCAGAGGAGGCAGCAGG-3. i antysensowny 5 (3-GCAACATTCAGCCGTTCAA-3. (temperatura hybrydyzacji, 62 ° C); i GUCY1B3, sens 5. -AGGAATCACGCATCAGCC-3. i antysensowny 5a-TATGAGGACGAACCAGCGA-3. (temperatura wygrzewania, 62 ° C). cDNA wytworzono przy użyciu zestawu do syntezy cDNA RevertAid First Strand (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Niemcy). Generację specyficznych produktów PCR potwierdzono za pomocą analizy krzywej topnienia i elektroforezy żelowej. Każdą parę starterów testowano za pomocą logarytmicznego rozcieńczenia mieszaniny cDNA w celu wygenerowania liniowej krzywej standardowej (punkt przecięcia [CP] wykreślony względem logu stężenia matrycy), który wykorzystano do obliczenia wydajności par primera (E = 10 (. / nachylenie)). ELF1. mRNA stosowano jako wzorzec zewnętrzny, ponieważ jego ekspresja nie uległa znaczącym zmianom w starzejącym się w porównaniu do wcześnie przechodzącego konfluentnego HDF (dane nie pokazane). Do analizy danych zastosowano metodę maksimum drugiej pochodnej, a indukcję gatunku cDNA (genX) obliczono zgodnie z Pfaffl (16) w następujący sposób: Pomiar zawartości DNA i apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki trypsynizowano. Komórki zarówno przylegające, jak i pływające przemyto jednokrotnie PBS i utrwalono na lodzie w 70% etanolu przez ponad 2 godziny, przemyto raz PBS i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w roztworze barwiącym zawierającym 50 .g / ml jodku propidyny (PI ), 0,2 mg / ml RNazy A i 0,1% (obj./obj.) Triton X-100 w PBS. Oznaczenie ilościowe komórek apoptotycznych przeprowadzono za pomocą zestawu do wykrywania apoptozy aneksyny V-FITC (BD Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA). Próbki analizowano za pomocą urządzenia FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, Kalifornia, USA) [patrz też: masaż leczniczy kręgosłupa, ankos zapasy warszawa, centermed słoneczna tarnów ] [podobne: zapytaj trenera, mma core, mmacore ]