Indukcja inhibitora Cdk p21 przez LY83583 hamuje proliferację komórek nowotworowych w sposób niezależny od p53 ad 7

Pokazano wyniki analizy Western blot z lizatem p53. Komórki HCT116 traktowane 1,5. M LY. Błony sondowano przeciwciałami swoistymi dla p21 i, jako kontrolą obciążenia, a -tubuliną. Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Metody. Zgodnie z brakiem akumulacji p53 w HDF traktowanych LY, komórki HCT116 z niedoborem p53 opracowane przez Bunza i in. (33) wykazało pełny blok proliferacji po dodaniu LY (Figura 4b). Tożsamość trzech różnych linii komórkowych HCT116 użytych w tym badaniu potwierdzono przez traktowanie adriamycyną, która indukuje przerwy dwuniciowe DNA (Figura 4c). Zgodnie z oczekiwaniem, tylko komórki HCT116 typu dzikiego wykazywały indukcję białka p21 po ekspozycji na adriamycynę (Figura 4c). Komórki HCT116 z niedoborem p53 i przejściowo transfekowane konstruktem reporterowym ludzkiego promotora p21 poddanego fuzji z genem lucyferazy wykazywały ponad 10 krotny wzrost aktywności lucyferazy po 12 godzinach leczenia LY (fig. 4d). Poziomy mRNA p21 i białka p53y / p Komórki HCT116 po traktowaniu LY indukowano kinetyką podobną do obserwowanej w HDF (Figura 4, e i f). Wyniki te wykluczają p53, a tym samym indukcję uszkodzenia DNA jako mediatora zatrzymania cyklu komórkowego przez LY i indukcję ekspresji p21. Ponadto, leczenie LY nie prowadziło do indukcji inhibitorów Cdk p27 i p15 (danych nie pokazano). Ponadto, proliferacja MEF z niedoborem p16 INK4A została zahamowana przez LY, pokazując, że p16INK4A nie jest wymagany dla wpływu LY na cykl komórkowy (dane nie pokazane). Wspierając ten wniosek, linie komórkowe raka jelita grubego HCT116 stosowane w tym badaniu nie wyrażają funkcjonalnego p16INK4A; jeden allel p16INK4A przenosi mutację punktową inaktywującą, a inny allel p16INK4A jest całkowicie wyciszony z powodu metylacji dinukleotydu cytozynofosforan-guanozyna (34). Podsumowując, wyniki te pokazują, że hamujące działanie LY na proliferację odbywa się za pośrednictwem indukcji p21. Konwersja indukowanego przez LY zatrzymania do apoptozy w komórkach ujemnych względem pRb. Ponieważ antyproliferacyjne działanie p21 odbywa się za pośrednictwem białek kieszonkowych (pRb, p107, p130) (omówionych w 30), analizowaliśmy odpowiedź komórek z niefunkcjonalnymi białkami kieszonkowymi do leczenia LY. Izogeniczne linie komórkowe NIH3T3-L1 (opisane w 35) trwale eksprymujące albo duży antygen SV40 T albo duży punkt SV40 mutanta punktu antygenu T (K1) (36) z niedoborem wiązania i inaktywujące białka kieszeni traktowano LY. Komórki NIH3T3-L1 wyrażające mutant K1 wykazywały hamowanie proliferacji, podczas gdy komórki NIH3T3-L1 eksprymujące duży antygen SV40 typu dzikiego uległy apoptozie (Figura 5, aib). Indukcję apoptozy przez LY dodatkowo oznaczono ilościowo stosując barwienie aneksyną V (Figura 5c). Figura 5 Wpływ LY na komórki z inaktywowanymi szlakami pRb. (a) Odpowiedź linii komórkowych z uszkodzeniami w szlaku pRb do LY. Komórki NIH3T3-L1 wyrażające duże antygeny T SV40 (LT3) i NIH3T3-L1 eksprymujące mutanta punktowego dużego antygenu T SV40 niezdolnego do wiązania białek podobnych do pRb (K1) traktowano 1,5. M LY. Liczby komórek oznaczano we wskazanych punktach czasowych w trzech powtórzeniach. (b) Morfologia komórek NIH3T3-L1 po leczeniu LY. Mikroskopia z kontrastem fazowym została przeprowadzona po inkubacji komórek NIH3T3-L1-K1 (K1) i NIH3T3-L1-LT3 (LT3) w 1,5. M LY przez 3 dni (powiększenie, x 100). (c) Kwantyfikacja wczesnych stadiów apoptozy. Komórki K1 i LT3 (komórki kontrolne i komórki traktowane LY przez 48 godzin) poddano podwójnemu barwieniu za pomocą anty-aneksyny V i PI w celu rozróżnienia żywych, wczesnych apoptotycznych i późnych apoptotycznych / martwiczych populacji i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazano procent komórek PI-ujemnych, aneksyny V-dodatnich. (d) Indukcja apoptozy przez LY. Komórki HeLa eksprymujące histonowe białko fuzyjne H2B-eGFP (dostarczone przez G. Wahl) traktowano 2. M LY przez 48 godzin, a morfologię chromatyny w żywych komórkach analizowano przy długości fali 495 nm. (e) Kwantyfikacja apoptozy przez wykrywanie komórek z zawartością DNA sub-G1. Komórki HeLa traktowano LY przez 60 godzin. Zawartość DNA oznaczono po wybarwieniu PI, jak opisano w Metodach. W celu rozszerzenia tych obserwacji na ludzkie komórki rakowe analizowano linie komórkowe HeLa i HEK293. Linia komórkowa raka szyjki macicy HeLa eksprymuje białko E7 kodowane przez wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV), które wiąże się i inaktywuje białka kieszonkowe. W komórkach HEK293 adenowirusowe białko E1A spełnia analogiczne funkcje. Komórki HeLa i HEK293 nie zatrzymały się po leczeniu LY, ale zamiast tego uległy śmierci komórkowej, czemu towarzyszyło kurczenie się komórek sugerujące apoptozę (dane nie przedstawione)
[przypisy: masaż nuru na czym polega, zapytaj trenera, ciasto marchewkowe wegańskie ]
[hasła pokrewne: mleko w proszku dla dzieci, centermed słoneczna tarnów, fundacja dzieciom zdążyć z pomocą logowanie ]