Indukcja inhibitora Cdk p21 przez LY83583 hamuje proliferację komórek nowotworowych w sposób niezależny od p53 ad 6

Po rozdzieleniu na żelu gradientowym 4. 20% i przeniesieniu na membrany PVDF, białka wykrywano przeciwciałami przeciwko ludzkiemu p21, p53, p16 i. jako kontrola obciążenia. P-tubulina. (c) status fosforylacji pRb po traktowaniu LY. Po dodaniu LY przez wskazane okresy przygotowano lizaty komórkowe i białka rozdzielono na żelu PAGE denaturującym z gradientem 7-12%. Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Metody; ppRb, hiperfosforylowane pRb; pRb, podfosforylowany pRb. Głównymi celami cyklu komórkowego inhibitora Cdk p21 są zależne od cyklin kinazy 2, 4 i 6 (28, 29), które utrzymują białka kieszeni pRb, p107 i p130 w nieaktywnym stanie hiperfosforylowanym podczas postęp cyklu (recenzja w 30). Zatem, zahamowane przez p21 kompleksy Cdk / cyklina związane z fazą G1 / S prowadzą do podfosforylacji kieszonkowych białek, co umożliwia ich późniejsze wiązanie i hamowanie czynników transkrypcyjnych E2F. Związek pomiędzy kieszonkowymi białkami i E2Fs powoduje zahamowanie progresji i proliferacji G1 / S (patrz punkt 31). Zgodnie z indukcją p21 przez LY, status fosforylacji pRb zmieniał się szybko po dodaniu LY; już po 6 godzinach stosunek fosforylowanej do podfosforylowanej, aktywnej pRb wyraźnie przesunął się w kierunku postaci podfosforylowanej, a po 19 godzinach pRb był prawie całkowicie podhofosforylowany (Figura 2c). Nawet po przedłużeniu leczenia LY do 12 dni, podfosforylowanie pRb nie zostało odwrócone (Figura 2c). Wyniki te pokazują, że LY hamuje proliferację przez indukowanie p21 do poziomów, które są wystarczające do hamowania aktywności Cdk i aktywowania funkcji hamującej cyklu komórkowego pRb. Wpływ LY na proliferację komórek rakowych. W celu ustalenia, czy LY może być przydatna do zakończenia proliferacji komórek rakowych, linie komórkowe raka jelita grubego (HCT116, DLD1), linię komórkową pochodzącą z raka piersi (MCF7) i linię komórek czerniaka (A-375) analizowano po dodaniu LY; wszystkie linie komórkowe wykazywały całkowite zaprzestanie proliferacji komórek (Figura 3a). Zgodnie z ustaleniami w HDF, komórki HCT116 wykazywały indukcję p21 na poziomie białka po dodaniu LY (Figura 3b). Ponadto, mRNA p21 indukowano przez LY w komórkach MCF7 (dane nie przedstawione). Ryc. 3 Wpływ LY na komórki raka nabłonka. (a) Krzywe wzrostu komórek MCF7, A-375, HCT116 i DLD1. Komórki trypsynizowano we wskazanych punktach czasowych i oznaczano liczbę komórek. (b) Indukowanie białka p21 po leczeniu LY. Komórki raka okrężniczo-odbytniczego HCT116 traktowano 1,5. M LY we wskazanych okresach. Lizaty komórkowe przygotowano i poddano analizie Western blot. Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Metody. Wymóg p21, ale nie p53, dla hamowania proliferacji przez LY. Aby określić, czy indukcja p21 jest niezbędna do hamowania proliferacji przez LY, komórki HCT116 z niedoborem p21, generowane przez homologiczną rekombinację przez Waldmana i in. (32), zostały przeanalizowane (rysunek 4a); Komórki HCT116 z niedoborem p21 były w dużej mierze odporne na LY, podczas gdy komórki HCT116 typu dzikiego wykazywały całkowite zaprzestanie proliferacji (Figura 3a). Te wyniki pokazują, że p21 jest wymagany do hamującego działania LY na proliferację komórkową. Figura 4 Występowanie p21, ale nie p53, dla hamowania proliferacji przez LY. (a) Odpowiedź komórek raka jelita grubego HCT116 z niedoborem p21 do LY. Komórki traktowano LY lub, jako kontrolę, nośnikiem (DMSO) i oceniano liczbę komórek. Pomiary przeprowadzono w trzech powtórzeniach. (b) Odpowiedź p53 + / + i p53. /. Komórki HCT116 do LY. Komórki traktowano LY lub, jako kontrolę, nośnikiem (DMSO) i oceniano liczbę komórek. Pomiary przeprowadzono w trzech powtórzeniach. (c) Analiza linii komórkowych z nokautem HCT116. Pokazano wyniki analizy Western blot poziomów białka p53 i p21 po dodaniu adriamycyny przy 0,2 ug / ml przez 8 godzin. (d) aktywność reportera promotora p21 w komórkach HCT116 z niedoborem p53 po leczeniu 1,5. M LY przez 12 godzin. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Metody. (e) niezależna od p53 indukcja p21 mRNA przez LY. Pokazano wyniki analizy Northern blot z RNA wyizolowanym we wskazanych punktach czasowych po dodaniu 1,5. M LY do komórek HCT116 z niedoborem p53
[więcej w: zapytaj trenera, mleko w proszku dla dzieci, trening pod sztuki walki ]
[więcej w: ciasto marchewkowe wegańskie, powiększone węzły chłonne w jamie brzusznej, goździki właściwości lecznicze ]