Indukcja inhibitora Cdk p21 przez LY83583 hamuje proliferację komórek nowotworowych w sposób niezależny od p53 ad 5

Zgodnie z indukcją starzenia komórkowego, hamowanie proliferacji przez LY było nieodwracalne po okresie leczenia trwającym dłużej niż 2 dni (Figura 1e). Rozbudowane leczenie HDF LY przez 8 dni nie spowodowało znacznego zmniejszenia liczby komórek z powodu śmierci komórki, ale skutkowało stabilnym hamowaniem proliferacji (Figura 1e). W celu scharakteryzowania zatrzymania cyklu komórkowego indukowanego przez LY, HDF zsynchronizowano w fazie G1 przez konfluencję (91,2% fazy G1 i 2% fazy S), a następnie uwolniono przez trypsynizację (Figura 1f); nietraktowane komórki weszły w fazę S z wysokim odsetkiem. Dodanie LY prawie całkowicie zablokowało wejście HDF do fazy S, co sugeruje, że LY działa podczas fazy G1 cyklu komórkowego. Ponadto dodanie 1. M LY do zsynchronizowanych HDF spowodowało całkowite zahamowanie syntezy DNA, jak określono przez inkorporację BrdU (Figura 1g). Analiza mikromacierzy genów regulowanych przez LY. W celu zidentyfikowania dalszych mediatorów indukowanego przez LY zatrzymania cyklu komórkowego i starzenia, przeprowadzono analizę mikromacierzy HDF poddanych obróbce LY z użyciem tych samych macierzy, które zastosowano do analizy replikacyjnego starzenia w HDF opisanych powyżej (szczegóły, patrz Metody ). RNA wyizolowano 36 godzin po ekspozycji wczesnych pasaży HDF na LY. Kontrolny RNA izolowano z konfluentnych wczesnych pasaży HDF. W HDF, które osiągnęły starzenie repliacyjne, indukowano 216 transkryptów, podczas gdy 272 mRNA indukowano po leczeniu LY. Zaobserwowano represję 266 mRNA w HDF poddawanych replikacyjnemu starzeniu, podczas gdy 294 mRNA represjonowano po leczeniu LY. Występowało znaczne nakładanie się genów o różnej ekspresji obserwowanych podczas starzenia się replikacyjnego i podczas indukowanego LY starzenia, z 114 analogicznie regulowanymi transkryptami (Tabela 3). Wśród nich były geny, które wcześniej zidentyfikowano jako zmiennie regulowane podczas starzenia replikacyjnego: PAI-1, metaloproteinazy macierzy 10, fibryliny, cdc25b, cykliny D1, fibromoduliny i specyficznego czynnika 2 osteoblastu (11, 20, 21). Jednak większość zidentyfikowanych tutaj genów stanowi nowe dodatki do rosnącej liczby genów zidentyfikowanych jako komponenty programu starzenia się. Wspierając to pojęcie, wiele połączonych genów ma funkcje, które mogą przyczyniać się do fenotypu komórek zatrzymanych w końcowej fazie. Na przykład, obniżenie poziomu receptora PDGF. i . łańcuchy mogą przyczyniać się do stanu refrakcji starzejących się komórek, które nie reagują na stymulację mitogenną czynnikami wzrostu (tabela 2). Zmiany ekspresji obserwowane w genach kodujących składniki cytoszkieletu (np. A-1-tubulina, a2-tropomiozyna, y -filamina C, a-aktynina) mogą przyczyniać się do spłaszczonego i powiększonego kształtu charakterystycznego dla starzejących się HDF (Figura 1a) . Co ciekawe, mRNA sGCa3 regulowano w dół w HDF traktowanych LY (Tabela 3 i Figura 1b). Tabela 3Ddekstrakcja 114 mRNA o strukturze rdzeniowej w replikatywnej starzeniu i komórkach traktowanych LY za pomocą analizy mikromacierzy Szybka indukcja p21WAF1 / CIP1 / SDI przez LY. Wśród genów indukowanych zarówno przez starzenie replikujące jak i LY było p21WAF1 / CIP1 / SDI (Tabela 3), który koduje inhibitor kinaz zależnych od cyklin (Cdks). Kompleksy Cdk / cyklina stymulują postęp i proliferację cyklu komórkowego przez fosforylację kluczowych substratów (omówiono w 26). Ponieważ indukcja p21 mogłaby potencjalnie wyjaśnić działanie antyproliferacyjne LY, bardziej szczegółowo przeanalizowaliśmy związek pomiędzy LY i p21. Sześć godzin po traktowaniu LY poziomy mRNA p21 w HDF były podobne do poziomów obserwowanych 6 godzin po dodaniu adriamycyny, jak pokazano w analizie Northern blot (Figura 2a). Jednak po leczeniu LY poziom białka p53, który konsekwentnie wzrasta po wytworzeniu uszkodzenia DNA i pośredniczy w transaktywacji p21, nie wzrósł (Figura 2b), co wskazuje, że LY nie indukuje uszkodzenia DNA. Indukcja mRNA p21 przez adriamycynę pokazuje, że szlaki sygnalizacyjne niezbędne do aktywacji p53 były nadal nietknięte w użytych HDF (Figura 2a). Indukcję białka p21 wykrywano między 3 a 6 godzin po dodaniu LY, podczas gdy inhibitor Cdk p16INK4A nie był indukowany nawet po 48 godzinach leczenia LY (Figura 2b). Wynik ten był nieoczekiwany, ponieważ p16INK4A jest powszechnie indukowany w scenariuszach prowadzących do przedwczesnego starzenia się. na przykład ektopowa ekspresja aktywowanego genu ras (27) lub suboptymalne warunki hodowli komórkowej (10). Figura 2 Wpływ LY na ekspresję i fosforylację białek regulatorowych cyklu komórkowego
[hasła pokrewne: mleko w proszku dla dzieci, dieta przyspieszająca metabolizm jadłospis, ciasto marchewkowe wegańskie ]
[hasła pokrewne: masaż leczniczy kręgosłupa, koszt rezonansu magnetycznego, dieta przyspieszająca metabolizm jadłospis ]