Hamowanie PKC łagodzi fenotyp serca w mysim modelu dystrofii miotonicznej typu 1 ad 6

Ro-31-8220 podawano równocześnie z indukcją CUGBP1 przez doksycyklinę, ale nie zapobiegał on śmiertelności myszy z nadekspresją CUGBP1. Western bloty z użyciem przeciwciał fosfo-specyficznych wykazują, że PKCa / yll nie był aktywowany przez nadekspresję CUGBP1 (Figura 6B). Wyniki te pokazują, że Ro-31-8220 nie poprawia efektów regulacji w górę CUGBP1 za pośrednictwem mechanizmu niezależnego od PKC i silnie sugeruje, że plejotropowe działanie tego leku nie wyjaśnia jego wpływu na myszy eksprymujące EpA960. RNA. Figura 6Ro-31-8220 nie zapobiega śmiertelności u myszy z nadekspresją CUGBP1. (A) Krzywa przeżycia Kaplan-Meier transgenicznych zwierząt (MHC-rtTA / TRECUGBP) indukowała ekspresję CUGBP1, z podawaniem doksycykliny w połączeniu z Ro-31-8220 (DOX + Ro-31-8220) lub roztworem soli z doksycykliną (DOX ). Ludzki CUGBP1 ekspresjonowano w sposób indukowalny w sercach dorosłych myszy, stosując pokarm zawierający 6 g / kg doksycykliny (DOX). (B) aktywacja PKCa / yll indukowanych myszy MHC-rtTA / TRECUGBP, z lub bez podawania Ro-31-8220. Aktywację PKC określono metodą Western blot stosując przeciwciało przeciw fosfo-PKC (3 (75 kDa). GAPDH został użyty jako kontrola obciążenia. Molekularne cechy DM1 pojawiają się po wycofaniu Ro-31-8220. Aby określić, czy wycofanie Ro-31-8220 z myszy eksprymujących EpA960. RNA ma długotrwałą ochronę, grupa 6 zwierząt otrzymywała codzienne iniekcje Ro-31-8220 przez 43 dni, a następnie utrzymywana przez 22 dni bez Ro -31-8220 wstrzyknięć (myszy TAM-Ro-31-8220-stop, Figura 7). Wszystkie 6 myszy żyło pod koniec badania. Analiza molekularna wykazała, że aktywność PKC (3 (3 II była porównywalna lub nawet wyższa w tkance sercowej od myszy, u których wycofano Ro-31-8220, w porównaniu z tą u myszy leczonych solą fizjologiczną indukowaną tamoksyfenem (Figura 7A, ścieżki 8. 11) . Zgodnie z pojawieniem się aktywowanego PKC (3 /, II zwierzęta te również wykazywały wysoki poziom CUGBP1 (Figura 7A, ścieżki 8. 11), który był hiperfosforylowany (Figura 7B). Poziom koneksyny 43 był zmienny u myszy, ale ogólnie wydaje się, że wycofanie Ro-31-8220 nie wpłynęło na ekspresję koneksyny 43 u 3 z 4 myszy, co sugeruje, że nie wszystkie działania Ro-31-8220 były odwracalne po wycofaniu. Rysunek 7 Cechy molekularne DM1 pojawiają się ponownie po wycofaniu Ro-31-8220. (A) Analiza Western blot CUGBP1, fosfo-PKCa / P II, całkowitego PKCa / P II i koneksyny 43 w tkance serca od myszy kontrolnych (MCM) (ścieżki i 2), myszy leczone tamoksyfenem (TAM) (wszystkie 5 myszy umarło w ciągu 3 tygodni) (ścieżki 3. 7) i myszy traktowane Ro-31-8220 przez 43 dni, a następnie usunięto lek przez 22 dni (Ro-31-820-STOP) (ścieżki 8. 11) ). GAPDH został użyty jako kontrola obciążenia. (B) Analiza 2D / Western blot CUGBP1 w grupach MCM, TAM i Ro-31-8220-STOP. (C) Zarówno splicingowe zdarzenia specyficzne dla CUGBP1 i MBNL1 były źle regulowane w tkankach serca od zwierząt z ro-31-8220-STOP. Podano liczbę zwierząt w grupie do analizy RT-PCR (średnia . SEM). * P <0,05 względem sterowania MCM. Następnie ustaliliśmy, czy zdarzenia splicingu regulowane przez CUGBP1 były nieprawidłowo regulowane u myszy TAM-Ro-31-8220-stop. Składanie eksonu 21 i eksonu 6 Ank2 było źle uregulowane w myszach z TAM-RO-31-8220 (Figura 7C), a podczas gdy składanie eksonów 16 z egzonów Mtmr3 było niewłaściwe, podobnie jak myszy tamoksyfenowe leczone solą fizjologiczną, nie różniło się ono istotnie od splicingu u zwierząt MCM, które nie eksprymują EpA960. RNA. Zgodnie z oczekiwaniem, wzory splicingu dla wszystkich celów MBNL1 były źle uregulowane wśród zwierząt traktowanych z lub bez Ro-31-8220 w porównaniu z grupą kontrolną MCM (Figura 7C). Podsumowując, wyniki te wskazują, że wycofanie Ro-31-8220 prowadzi do ekspresji aktywowanego PKC, hiperfosforylowanego i zwiększonego CUGBP1 i nieprawidłowej regulacji specyficznych dla CUGBP1 zdarzeń składania. Podczas gdy myszy te przeżyły 22 dni bez Ro-31-8220, nie wiadomo, czy fizjologia mięśnia sercowego myszy została zakłócona. Ponadto możliwe jest, że myszy eksprymujące EpA960 (R) RNAa mogą doświadczać opóźnionego fenotypu po dłuższych okresach po odstawieniu Ro-31-8220 (patrz dyskusja). Omówienie Utrata funkcji MBNL1 i podwyższony poziom białka CUGBP1 to 2 główne zdarzenia molekularne zaangażowane w patogenezę DM1 (6). Jednak poszczególne role CUGBP1 i / lub MBNL1 w fenotypie sercowym DM1 pozostają niezdefiniowane. Utrata określonych izoform MBNL1 u myszy rekapituluje kilka cech DM1, takich jak zaćma, miotonia i alternatywne defekty splicingu w mięśniu szkieletowym (10), podczas gdy jego rola w patogenezie serca DM1 jest nieznana. Konstytucyjna nadekspresja CUGBP1 w mysim sercu i mięśniach szkieletowych skutkuje śmiertelnością noworodków (19, 20) i indukowalną ekspresją w dorosłym sercu myszy powoduje arytmie, dysfunkcję skurczową i śmiertelność (nasze niepublikowane obserwacje) [przypisy: masaż leczniczy kręgosłupa, masaż nuru na czym polega, goździki właściwości lecznicze ] [hasła pokrewne: masaż nuru na czym polega, nr na pogotowie ratunkowe, ciasto z truskawkami moje wypieki ]