Hamowanie PKC łagodzi fenotyp serca w mysim modelu dystrofii miotonicznej typu 1 ad 5

(A) Ro-31-8220 i Ro-32-0432 zapobiegają błędnej regulacji 2 z 3 testowanych zdarzeń splicingu regulowanych CUGBP1. Analiza RT-PCR zdarzeń związanych z restrykcją regulowaną przez CUGBP1 u myszy kontrolnych MCM z zastosowaniem tamoksyfenu (MCM), myszy indukowanych do ekspresji EpA960. RNA bez (TAM) lub z (TAM-Ro-31-8220 lub TAM-Ro-32- 0432) podawanie inhibitorów PKC. Liczba myszy użytych w każdym zdarzeniu splicingu jest wskazana pod paskiem wykresu. Ekson Ank2 21, ekson Mtmr3 16 i ekson 6 sorbentu pokazano w grupach MCM, TAM, Ro-31-8220 i Ro-32-0432 (średnia . SEM). * P <0,05 względem sterowania MCM. (B) Ani Ro-31-8220, ani Ro-32-0432 nie wpływają znacząco na nieregulowane splicing specyficznych dla MBNL1 celów, oznaczanych ilościowo za pomocą analizy RT-PCR (średnia . SEM). * P <0,05 względem sterowania MCM. (C) Analiza 2D / Western MBNL1 w mysim sercu ujawnia rozległą modyfikację potranslacyjną, na którą nie ma wpływu ekspresja EpA960. RNA lub podanie Ro-31-8220. Analiza 1D / Western blot MBNL1 w tkankach serca MCM pokazuje 3 izoformy MBNL1 (przybliżone rozmiary, 41, 37, 31 kDa) (lewy panel). Analiza 2D / Western blot MBNL1 w tkankach serca od 2 różnych myszy w każdej grupie (MCM, TAM i TAM-Ro-31-8220) (prawy panel). Aby zbadać, czy EpA960 (R) RNA indukowało posttranslacyjne zmiany MBNL1, przeprowadziliśmy analizę 2D / Western blot. Zarówno w analizach 1D / Western, jak iw analizach 2D / Western, nasze królicze poliklonalne przeciwciało anty-MBNL1 rozpoznało 3 izoformy w dorosłym sercu mysiej (Figura 4C). Po analizie metodą 2D / Western blot, każda izoforma MBNL1 prezentowała wiele izoform o różnych wartościach pI, wskazujących na posttranslacyjne modyfikacje. Stwierdziliśmy, że wzory MBNL1 były podobne u nieleczonych myszy MCM i myszy indukowanych do ekspresji EpA960 (R) RNA z lub bez podawania Ro-31-8220 (Figura 4C). Wyniki wskazują, że MBNL1 jest szeroko modyfikowany w tkance serca dorosłej myszy i że zarówno rozszerzone CUG RNA, jak i podawanie Ro-31-8220 silnie nie wpływają na te modyfikacje. Drugi inhibitor PKC zapobiega śmiertelności u myszy eksprymujących EpA960. RNA. Aby potwierdzić, że polepszenie fenotypu serca wywołanego przez EpA960 I niesprawna synteza alternatywnego składania przez Ro-31-8220 wynikało raczej z hamowania PKC, a nie efektów poza cel, użyliśmy drugiego inhibitora PKC, Ro-32-0432. Okazało się, że Ro-32-0432 zmniejszyło śmiertelność i poprawiło anomalie skurczowe, ale nie było tak skuteczne jak Ro-31-8220 w zapobieganiu przedłużeniu PR (Tabela uzupełniająca 1, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI37976). Jeśli chodzi o Ro-31-8220, podawanie Ro-32-0432 również odwracało 2 z 3 zdarzeń splicingu CUGBP1 do normalnego, podczas gdy wszystkie 3 zdarzenia łączenia splicingowego MBNL1 były znacząco różne od wzoru dzikiego obserwowanego u myszy MCM (Figura 4). . Dziewięć na dziesięć myszy przeżyło przez 30 dni, gdy podano Ro-32-0432, z normalną funkcją lewej komory, podczas gdy 7 myszy wykazywało przedłużenie PR (Tabela uzupełniająca 1). Zauważyliśmy, że poziomy w stanie stacjonarnym i hiperfosforylacja CUGBP1 nie uległy całkowitemu odwróceniu u tych myszy, co korelowało z nieprawidłowościami w układzie przewodzenia (Figura 5 i Dodatkowe Figury i 2), ale ekspresja koneksyny 43 została częściowo przywrócona (Figura 5). Ogólnie, hamowanie PKC przez Ro-32-0432 lub Ro-31-8220 koreluje ze zwiększonym przeżyciem i poprawą funkcji serca; jednak Ro-31-8220 był lepszy w hamowaniu PKC i ochronie funkcji serca. Może to być spowodowane różnicami w profilach izoform PKC hamowanych (31) i / lub wydajności hamowania PKC przez te leki in vivo. Figura 5A Drugi inhibitor PKC umiarkowanie hamuje aktywację PKC i podwyższenie poziomu CUGBP1. Analiza Western błot CUGBP1, fosfo-PKCa / P II i koneksyny 43 w każdej grupie myszy jest pokazana (MCM, ścieżki i 2, TAM, ścieżki 3. 5 i TAM-Ro-32-0432, ścieżki 6. 13). GAPDH został użyty jako kontrola obciążenia. Hamowanie PKC nie poprawia śmiertelności z powodu nadekspresji CUGBP1 niezależnej od PKC. Wykazano, że obydwa stosowane tu inhibitory PKC (Ro-32-0432 i Ro-31-8220) polepszają kurczliwość serca po podaniu myszom z różnymi zaburzeniami kurczliwości serca (23). Aby określić, czy hamowanie PKC może mieć ogólny efekt regenerujący na zwierzętach eksprymujących EpA960. RNA niezależnie od zmniejszonej ekspresji CUGBP1, testowaliśmy działanie Ro-31-8220 w innym mysim modelu DM1, w którym ludzka CUGBP1 jest wyrażana w dorosłym sercu, stosując transgen indukowalny tetracykliną. Zwierzęta te wykazują około 80% śmiertelność w ciągu 3 tygodni od indukcji, jak również nieprawidłowości elektrofizjologiczne i kurczliwe podobne do myszy eksprymujących EpA960. RNA (nasze niepublikowane obserwacje). [hasła pokrewne: techniki mma, najlepsza odzywka do rzes, nr na pogotowie ratunkowe ] [przypisy: mleko w proszku dla dzieci, centermed słoneczna tarnów, fundacja dzieciom zdążyć z pomocą logowanie ]