Connexin 43 działa jako cytoochronny mediator transdukcji sygnału przez stymulowanie mitochondrialnych kanałów KATP w kardiomiocytach myszy cd

Podczas gdy antymycyna A (4 .g / ml), która stymuluje tworzenie ROS przez hamowanie kompleksu oddechowego III, zwiększyła nachylenie fluorescencji Amplex UltraRed zarówno w mitochondriach, jak i mitoplastach; ani DMSO ani diazoksyd rozpuszczalnika (200 .M) nie zmienił fluorescencji Amplex UltraRed w mitoplastach utrzymywanych w naszym roztworze typu patch-clamp (Figura 2, E i F), potwierdzając hipotezę, że w naszych warunkach eksperymentalnych diazoksyd nie miał istotnego niespecyficznego wpływu na mitochondria Produkcja ROS (18). Ponadto, zmiatacz ROS L-NAC (5 mM) nie zmieniał wyjściowych właściwości kanału mitoKATP i, w szczególności, nie łagodził indukowanej diazoksydem aktywacji kanału mitoKATP (Figura 2, C i D oraz Tabela 1), co wskazuje, że stymulacja Kanały mitoKATP przez diazoksyd nie są pośredniczone przez ROS. Ponieważ Cx43 znajduje się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (ryc. 1) (10, 12) i niedokrwienie lub farmakologiczne warunkowanie jest podważane przez niedobór Cx43 niezależnie od sprzężenia międzykomórkowego przez złącza luki (11), mieliśmy na celu ustalenie, czy mitochondrialny Cx43 może być niezbędny molekularny składnik przewodzących porów kanałów mitoKATP lub może przekazywać sygnały cytoochronne do tych kanałów. Aby zdefiniować rolę mitochondrialnego Cx43, zastosowaliśmy 4 uzupełniające podejścia, tj. Zapisy jednokanałowe: mitoplastów typu dzikiego w obecności (a) inhibitora koneksinowego, karbenoksolonu (10 .M) (19) i (b) Peptyd mimetyku Cx43 43GAP27 (250 ul) (20); i mitoplasty od (c) heterozygotycznych myszy z niedoborem Cx43 (Cx43 + / y) (10) i (d) z niedoborem Cx4343 (myszy traktowane 4-hydroksytamoksyfenem Cx43Cre-ER (T) / fl traktowane [4-OHTa]) ) (21), które mają bardziej wyraźny mitochondrialny CX43 knockdown w porównaniu z heterozygotycznym Cx43 + /. myszy (zawartość Cx43 w Cx43 + / y mitochondriów, 28,9%> 9,4% typu dzikiego; w Cx43Cre-ER (T) / fl + 4-OHT, 2,8%. 1,1% kontroli Cx43fl / fl; Figura 3F), podczas gdy omijanie bezpośredniej lub pośredniej kompensacji niedoboru Cx43 podczas rozwoju. We wszystkich tych 4 warunkach zaobserwowano prądy mitoKATP o jednostajnej przewodności i wyjściowej jednokanałowej charakterystyce podobnej do niestymulowanych zapisów mitoplastów typu dzikiego bez hamowania Cx43 (Figura 3, A. D i Tabele 1, 2 i 3). Jednakże, karbenoksolon, 43GAP27 i niedobór Cx43 w Cx43 + /. i myszy Cx43Cre-ER (T) / fl + 4-OHT znacząco osłabiły stymulację mitoKATP przez diazoksyd (Figura 3, AEE i Tabele . 3), co wskazuje, że wpływ diazoksydu na kanały mitoKATP odbywa się za pośrednictwem Cx43. To pojęcie było dodatkowo wspierane przez addytywny efekt 43GAP27 z genetycznym knockdown Cx43, tj. Peptyd mimetyku Cx43 zniosł aktywację kanału KATP za pośrednictwem diazoksydu w Cx43 + /. myszy (Figura 3C i Tabela 2). Zahamowanie kanałów mitoKATP przez MgATP (Cx43 + / A Po, całkowite, 0,27%. 0,09%, n = 4) i glibenklamidu zostało zatrzymane w obecności karbenoksolonu lub 43GAP27 w Cx43 + / r. myszy i myszy Cx43Cre-ER (T) / fl + 4-OHT (Figura 3D i Tabele 1. 3). Tabela 2 Parametry bramkowania kanałów mitoKATP i wpływ peptydu mimetyku Cx43 43GAP27 (250.M) na zachowanie jednokanałowe mitoKATP w typie dzikim i Cx43 + /. Myszy Tabela 3 Wpływ diazoksydu (100 .M) na zachowanie jednokanałowe mitoKATP w kontroli Cx43fl / fl i myszy Cx43Cre-ER (T) / fl + 4-OHT Aby przetestować, czy wrażliwość na diazoksyd kanałów mitoKATP może zostać uratowana przez zwiększenie mitochondrialna zawartość Cx43 w heterozygotycznym Cx43 + /. myszy, porównaliśmy poziomy białka Cx43 i wywołaną diazoksydem aktywację kanału mitoKATP w mitochondriach ze ściany przedniej ściany mięśnia sercowego (AW) poddanej IP (przez 10 minutowe niedokrwienie i 10 minutową reperfuzję) z mitochondriami z tylnej ściany mięśnia sercowego (PW, bez IP) tych samych zwierząt. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, IP zwiększyło mitochondrialne poziomy Cx43 w AW w porównaniu z PW (Figura 4A) (10), czemu towarzyszyło znacznie bardziej wyraźne stymulowanie kanałem mitoKATP za pośrednictwem diazoksydu (Figura 4, B. E), dodatkowo potwierdzając hipotezę, że Cx43 wpływa na indukowaną lekami aktywność kanału mitoKATP. Rysunek 4IP zwiększa mitochondrialną zawartość Cx43 w Cx43 + /. myszy i ratuje czułość diazoksydową kanałów mitoKATP (A. E). (A) Western blot Cx43 i MN-SOD w mitochondriach z AW poddanych IP i PW (bez IP) tego samego Cx43 + /. mysz (indukowany przez IP wzrost Cx43 znormalizowany do MN-SOD, 4,0. 0,9, n = 3). Białka mitochondrialne z lewej komory typu dzikiego (WT LV): kontrola pozytywna; Na + / K + -ATPaza: wykluczenie kontaminacji białkami sarcolemmal. (B) Wpływ diazoksydu na aktywność mitoKATP (przy ~ 60 mV) w Cx43 + / A myszy zostały wzmocnione przez IP (prawy) w porównaniu do kontroli (po lewej)
[podobne: techniki mma, mleko w proszku dla dzieci, goździki właściwości lecznicze ]
[hasła pokrewne: fundacja dzieciom zdążyć z pomocą logowanie, masaż nuru na czym polega, nr na pogotowie ratunkowe ]