Connexin 43 działa jako cytoochronny mediator transdukcji sygnału przez stymulowanie mitochondrialnych kanałów KATP w kardiomiocytach myszy ad

Prądy te można aktywować za pomocą diazoksydu otwierającego kanał mitoKATP (100 .M), który znacznie zwiększył prawdopodobieństwo otwarcia (Po, całkowite, 4,30%. 0,40%, n = 16, P <0,05) i średni czas otwarcia bez wpływu na pojedyncze amplituda kanału i konduktancja (rysunek 2A, rysunek 3, B, C i E oraz tabela 1). Kanały MitoKATP nie wykazywały zależnej od czasu aktywacji lub spływania (ciągły 9-sekundowy puls: Po, całkowity, 0,28%. 0,09% i 4,21%. 0,50% na początku i pod diazoksydem, n = 6). Aktywność kanału stymulowanego przez diazoksyd mitoKATP była hamowana przez nieselektywny inhibitor mitoKATP glibenklamid (10 (jM, Po, całkowity, 0,35%. 0,06%, n = 8) (Figura 2A i Tabela 1), selektywny inhibitor 5-hydroksydekanowego kwasu mitoKATP ( 100 | jM, Po, całkowita 0,26%> 0,16%, n = 6) i trójfosforan adenozyny magnezu (MgATP; 100 | jM; Po, całkowita 0,55%> 0,09%, n = 5). Tak więc, kanały mitoKATP są obecne u myszy typu dzikiego i wykazują właściwości podobne do tych poprzednio opisywanych dla szczurów (13, 14). Figura 2 Aktywacja jednokanałowa MitoKATP przez diazoksyd (100 .M) jest niezależna od ROS. (A) Struty mitoKATP linii podstawowej (po lewej) i aktywowane diazoksydem (w środku) mitoKATP u myszy typu dzikiego w konfiguracji z dołączonym mitoplastem przy. 60 mV, które blokowano 10. M glibenklamidem (po prawej). (B) Histogram amplitudy prądu mitoKATP w warunkach wyjściowych ujawnił średnią wartość równą. 0,83. 0,05 pA (n = 22). Vm, napięcie membrany. (C) Amplituda jednokanałowa (I) jako funkcja potencjałów testowych. Na przewodności skośne wyznaczone przez regresję liniową w indywidualnych doświadczeniach na myszach typu dzikiego nie wpływał zmiatacz ROS L-NAC (5 mM) z lub bez diazoksydu iz lub bez MgATP (100. M) w porównaniu z kontrolą (patrz Figura 3B). (D) wyjściowe właściwości jednokanałowe (po lewej), wpływ diazoksydu na aktywność kanału mitoKATP (w środku) i hamowanie kanału przez MgATP (po prawej) (przy ~ 60 mV) nie miały wpływu na L-NAC w porównaniu z kontrolą (A). (E) Skos fluorescencji Amplex UltraRed nietkniętych mitochondriów (10 .g białka) w buforze do inkubacji był znacznie zwiększony przez dodanie antymycyny A; n = 6, * P <0,05 względem kontroli. (F) Skos fluorescencji Amplex UltraRed z mitoplastów (50. G białka) w buforze typu patch-clamp był zwiększony przez antymycynę A, ale pozostał niezmieniony po dodaniu rozpuszczalnika DMSO lub diazoksydu; n = 6, * P <0,05 względem kontroli. Rycina 3 Aktywacja jednokanałowa MitoKATP przez diazoksyd (100 .M) jest zależna od obecności mitochondrialnego Cx43. (A) Wpływ diazoksydu na aktywność kanału mitoKATP (przy ~ 60 mV) był zmniejszony u myszy typu dzikiego przez karbenoksolon (10 .M) (górny lewy) i 43 .AP27 (250 .M) (górny prawy róg); w Cx43 + /. myszy (dolny lewy); i u myszy Cx43Cre-ER (T) / fl + 4-OHT (dolny prawy) w porównaniu z kontrolą (Figura 2A). (B) Amplituda jednokanałowa jako funkcja potencjałów testowych w przypadku nieobecności (po lewej) i obecności (po prawej) diazoksydu. Przewodnictwo pochyłości było podobne we wszystkich grupach. (C) Średnie wartości prawdopodobieństwa otwarcia (Po, ogółem) w kontroli, Cx43 + /. myszy, typu dzikiego + karbenoksolon, typu dzikiego + 43GAP27 i Cx43 + /. myszy + 43 GAP27 w nieobecności i obecności diazoksydu, jak wskazano; n wartości podano w nawiasach. * P <0,05 względem kontroli. (D) Średnie wartości prawdopodobieństwa otwarcia (Po, ogółem) u myszy kontrolnych Cx43fl / fl (czarny) i Cx43Cre-ER (T) / fl + 4-OHT (biały) przy braku i obecności diazoksydu i MgATP, jak wskazano; n wartości podano w nawiasach. * P <0,05 względem sterowania Cx43fl / fl; §P <0,05 względem kontroli Cx43fl / fl + diazoksydu; P <0,05 względem Cx43Cre-ER (T) / fl + 4-OHT. (E) Wpływ różnych napięć na stymulowane diazoksydem prawdopodobieństwo otwarcia mitoKATP (Po, ogółem) w grupie kontrolnej, typu dzikiego + karbenoksolonu i Cx43 + /. myszy. (F) Analiza Western blot poziomu białka Cx43 i MN-SOD w mitochondriach z myszy kontrolnych Cx43 + / +, Cx43 + /. myszy, myszy kontrolne Cx43fl / fl i myszy Cx43Cre-ER (T) / fl + 4-OHT. Wykresy słupkowe przedstawiają stosunki mitochondrialnego poziomu Cx43 znormalizowanego do MN-SOD; n wartości podano w nawiasach. * P <0,05 względem kontroli. Tabela Parametry bramkowania kanałów mitoKATP i wpływ diazoksydu, L-NAC, glibenklamidu i MgATP na zachowanie jednokanałowe mitoKATP u myszy typu dzikiego w nieobecności lub obecności karbenoksolonu Aby ocenić, czy działanie diazoksydu na aktywność kanału mitoKATP może być pośredniczone przez ROS, my (a) mierzyliśmy wpływ diazoksydu na mitochondrialne wytwarzanie H2O2 za pomocą testu Amplex UltraRed (15); i (b) wykonane zapisy kanału mitoKATP w obecności zmiatacza ROS N-acetylo-l-cysteiny (L-NAC) (16, 17) [więcej w: fundacja dzieciom zdążyć z pomocą logowanie, ciasto marchewkowe wegańskie, dieta przyspieszająca metabolizm jadłospis ] [przypisy: goździki właściwości lecznicze, mleko w proszku dla dzieci, centermed słoneczna tarnów ]