Connexin 43 działa jako cytoochronny mediator transdukcji sygnału przez stymulowanie mitochondrialnych kanałów KATP w kardiomiocytach myszy ad 8

Po standardowym Laemmli SDS-PAGE (12%) i analizie Western blot (Bio-Rad Tankblot system, membrana nitrocelulozowa) wykryto białka przy użyciu następujących pierwszorzędowych przeciwciał: Cx43 (1: 5000, królicze poliklonalne, ab11370, Abcam), GAPDH (1 : 200, królicze poliklonalne IgG, sc-25778, Santa Cruz Biotechnology Inc.), Na + / K + -ATPazy (1: 1000, królicze poliklonalne IgG, nr 3010, Cell Signaling Technology Inc.), retikulum sarkoplazmatyczne Ca2 + gen 2 pompy ( SERCA2A; 1: 100, kozie poliklonalne IgG, sc-8094, Santa Cruz Biotechnology Inc.), zależny od napięcia kanał anionowy (VDAC; 1: 1000, królicze poliklonalne IgG, nr 4866, Cell Signaling Technology Inc.), rozdzielające białko 2 (UCP2; 1: 100, kozie poliklonalne IgG, sc-6525, Santa Cruz Biotechnology Inc.), dysmutazą ponadtlenkową manganu (MN-SOD, 1: 1000, króliczą poliklonalną IgG, Upstate), fosforylowaną Cx43 przy serynie 368 (Cx43Ser368; 1: 500, królicze poliklonalne IgG, Cell Signaling Technology Inc.) i przeciwciało drugorzędowe z króliczej peroksydazy chrzanowej (1: 2,000, Sigma-Al drich). Inkubacje pierwotnych przeciwciał przeprowadzono przez noc w 4 ° C. Immunoreaktywne prążki barwiono odczynnikami ECL (Amersham Pharmacia Biotech) zgodnie z instrukcjami producenta. Analizę densytometryczną indukcji białka przeprowadzono przy użyciu kamery CCD (Raytest) z oprogramowaniem do analizy densytometrycznej AIDA (Raytest). Każdy Western blot przeprowadzono trzykrotnie, o ile nie wskazano inaczej. Immunoprecypitacja Cx43 z PKC .. Białka zostały przygotowane z izolowanych mitochondriów. Próbki (500 .g białka mitochondrialnego) inkubowano z anty-PKC. przeciwciało (królicze poliklonalne przeciwciało, 20 .g, Santa Cruz Biotechnology Inc.), przeciwciało anty-Cx43 (królicze poliklonalne anty-szczurzy całkowite Cx43, 25 .g, Zytomed) lub anty-królicze IgG przed wiązaniem z białkiem A. Kulki przemyto 3 razy 0,5 ml roztworu soli buforowanego fosforanem. Immunoprecypitowane białka rozdzielano elektroforetycznie na 10% żelach poliakrylamidowych, a następnie przenoszono na membrany nitrocelulozowe. Wejściowe lizaty i całkowite białko komorowe służyły jako kontrola. Przeprowadzono immunoblotting przeciwko VDAC (1: 1000, królicze poliklonalne IgG, nr 4866, Cell Signaling Technology Inc.), aby wykluczyć jakiekolwiek niespecyficzne koimmunoprecypitację. Inkubacje pierwotnych przeciwciał przeprowadzono przez noc w 4 ° C. Immunoreaktywne prążki wykrywano stosując SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce). Każda immunoprecypitacja została przeprowadzona w trzech powtórzeniach. Pobudzenie PKC i fosforylacja Cx43. Mitochondria wyizolowano z komór męskich samców myszy C57BL / 6J i oczyszczono metodą ultrawirowania z gradientem w gradiencie Percoll. Nieuszkodzone mitochondria stymulowano w buforze do inkubacji (w mM: 125 KCl, 10 Tris-MOPS, 1,2 Pi-Tris, 1,2 MgCl2, 0,02 EGTA, 5 glutaminian, 2,5 jabłczanu, pH 7,4) z dodatkiem 200 .M ATP przez 30 minut w 25 ° C. ° C z ciągłym wytrząsaniem bez lub z peptydem aktywującym PKC. RACK (5. M). Po stymulacji białka mitochondrialne izolowano w x buforze do lizy komórkowej (zawierającym mM: 20 Tris pH 7,5, 150 NaCl, EDTA, EGTA, 2,5 pirofosforanu sodu, P-glicerofosforan, Na3VO4, 1% Triton X-100 .g / ml leupeptyny, uzupełnionej × kompletnym koktajlem inhibitorów proteazy [Roche]). Po sonikacji próbki odwirowano przy 14 000 g przez 10 minut w 4 ° C. Stężenie białka w supernatancie oznaczano przy użyciu zestawu Protein Dc Kit (Bio-Rad). Dziesięć mikrogramów białek mitochondrialnych lub prawokomorowych poddano analizie Western blot (patrz powyżej). Natężenie sygnału Cx43Ser368 znormalizowano do odpowiednich sygnałów MN-SOD. Immunoreaktywne sygnały MN-SOD normalizowano również do barwienia Ponceau S, aby zapewnić, że MN-SOD jest odpowiedni jako białko odniesienia. Sygnały zostały określone ilościowo za pomocą oprogramowania Scion Image (Scion Corp.). Pomiar H2O2. Wytwarzanie H2O2 mierzono za pomocą Amplex UltraRed (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, 10. G nietkniętych mitochondriów myszy C57BL / 6J inkubowano z 50. M Amplex UltraRed i 0,1 U / ml peroksydazy chrzanowej w buforze do inkubacji (w mM: 125 KCl, 10 Tris-MOPS, 1,2 Pi-Tris, 1,2 MgCl2 0,02 EGTA, 5 glutaminianu, 2,5 jabłczanu, pH 7,4) bez antimycyny A. Wytwarzanie H2O2 mierzono od 50 .g mitoplastów w roztworze typu patch-clamp bez lub z antymycyną A, diazoksydem lub nośnikiem DMSO, jako wskazany. Fluorescencję mierzono przez 10 minut w sposób ciągły za pomocą spektrofotometru Varian Cary Eclipse przy długościach fal wzbudzenia / emisji 565/581 nm. Usunięto fluorescencję tła buforu bez mitochondriów i obliczono nachylenie. Materiały i analiza statystyczna W niektórych eksperymentach, MgATP, diazoksyd, glibenklamid, kwas 5-hydroksydekanowy, karbenoksolon (19), PMA, 4a-PMA, L-NAC (Sigma-Aldrich), specyficzny dla PKC . peptyd aktywujący. RACK (HDAPIGYD, syntetyzowany o stwierdzonej czystości> 95% przez EZBiolab) (7) i / lub peptyd mimetyku Cx43 43GAP27 (SRPTEKTIFII, syntetyzowany o podanej czystości> 85% przez Eurogentec) (20) dodano do roztworów kąpieli, jak wskazano. Połączone dane są przedstawione jako średnie. SEM. Porównania między grupami przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej ANOVA lub testu dwustronnego studenta (fosforylacja Cx43). Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Podziękowania Podziękowania dla Nadine Henn i Iris Berg za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez dotacje z Deutsche Forschungsgemeinschaft (Ho 2146 / 3-3, Schu 843 / 7-1, 7-2), Köln Fortune oraz Marga i Walter Boll-Stiftung (do UC Hoppe). Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Cytat za ten artykuł: J Clin Invest. 2010; 120 (5): 1441. 1453. doi: 10,1172 / JCI40927.
[podobne: łojotokowe zapalenie skóry głowy wypadanie włosów, koszt rezonansu magnetycznego, masaż leczniczy kręgosłupa ]
[przypisy: koszt rezonansu magnetycznego, dieta przyspieszająca metabolizm jadłospis, ciasto marchewkowe wegańskie ]