Connexin 43 działa jako cytoochronny mediator transdukcji sygnału przez stymulowanie mitochondrialnych kanałów KATP w kardiomiocytach myszy ad 7

Supernatant zawierający subkolemermiczne mitochondria poddano peletowaniu (8500 g, 10 minut, 4 ° C). Mitochondria dodatkowo oczyszczono przez 2 dodatkowe cykle wirowania (8500 g, 10 minut, 4 ° C) i ostateczny osad ponownie zawieszono w roztworze K + (w mM: 150 KCl, 5 K-HEPES, CaCl2, pH 7,2). Izolowane nietknięte międzyfibrylarne mitoplasty zostały przygotowane z wyizolowanych mysich serc, jak opisano wcześniej (12). W skrócie, mysie serca usunięto szybko po dekapitowaniu i przemyto je buforem A (w mM: 100 KCl, 5 MgSO4, kwas 50 3- [N-morfolino] -propanosulfonowy (MOPS), EGTA, MgATP, pH 7,4) . Tkanka komorowa była rozdrabniana w 10 ml / g buforu B (bufor A plus 0,04% BSA), homogenizowana w rozdrabniaczu Potter-Elvehjem i wirowana przy 800 g przez 10 minut. Pelet zawierający mitochondria między włóknotwórcze ponownie zawieszono w buforze B, traktowano przez minutę za pomocą nitazy (8 U / g tkanki [bakteria, typ XXIV, Sigma-Aldrich]), homogenizowano za pomocą rozdrabniacza Potter-Elvehjem i wirowano przy 800 g dla 10 minut. Supernatant dalej oczyszczono przez dodatkowy cykl wirowania (8000 g, 10 minut, 4 ° C) i końcowy osad ponownie zawieszono w roztworze K + (w mM: 150 KCl, 5 K-HEPES, CaCl2, pH 7,2). Mitochondria przechowywano w 4 ° C przez 48 godzin w eksperymentach patch-clamp. Mitoplasty zostały przygotowane z nietkniętych mitochondriów przed łataniem lub przygotowaniem białka za pomocą wstrząsu osmotycznego lub digitoniny, jak opisano wcześniej (14, 40). Nagrania jednokanałowe. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w konfiguracji mitoplastowej techniki patch-clamp (180 impulsów testowych o czasie trwania 150 ms przy 1.67 Hz, jeśli nie wskazano inaczej, częstotliwość próbkowania, 10 kHz, częstotliwość narożna, 2 kHz) z symetryczną kąpielą i roztwór pipety złożony z (w mM): 150 KCl, 10 K-HEPES; Wartość pH doprowadzono do 7,2 za pomocą KOH, jak opisano wcześniej (13, 38). Prądy zostały zarejestrowane i zdigitalizowane za pomocą wzmacniacza Axopatch 200B i interfejsu Digidata 1200 (Axon Instruments) za pomocą niestandardowego oprogramowania (program CDE-REVL-LEVL / X, wersja 1.3) (41, 42). Analiza jednokanałowa. Analiza jednokanałowa została przeprowadzona przy użyciu niestandardowego oprogramowania tylko z 1-kanałowych łat, jak wcześniej podano (13, 37, 43, 44). Liniowy wyciek i prądy pojemności zostały cyfrowo odjęte przy użyciu średnich prądów nieaktywnych ruchów. W celu szczegółowej analizy bramkowania, wyidealizowane prądy analizowano w krokach co 150 ms (chyba że wskazano inaczej). Aktywne przeciągnięcia zdefiniowano jako aktywne z co najmniej jednym otwarciem. Otwarte prawdopodobieństwo aktywnych przebiegów (Po, aktywne, zdefiniowane jako zajętość stanu otwartego podczas aktywnych skoków), dostępność (część skoków zawierających co najmniej otwarcie kanału) i Ipeak (średni prążek w średnim prądzie) zostały obliczone przy 60 mV (o ile nie wskazano inaczej). Całkowite prawdopodobieństwo otwarcia (Po, całkowite, zdefiniowane jako zajętość stanu otwartego podczas całkowitego czasu trwania impulsu) analizowano dla 9-sekundowych czasów trwania impulsu przy ~ 60 mV 180 przebiegów z czasem trwania 150 ms lub, jeśli to wskazane, ciągłego impulsy. Amplitudy jednokanałowe zostały wyznaczone przez bezpośrednie pomiary w pełni rozdzielonych otworów dla obliczeń konduktancji lub jako maksimum pasma Gaussa pasującego do histogramów amplitudowych. Stałe czasowe histogramów czasu otwartego (. Open) i zamkniętego (. Closed) uzyskano za pomocą estymacji maksymalnego prawdopodobieństwa simpleks dla otwartych i zamkniętych rozkładów czasowych na wszystkich poziomach. IP. Zastosowaliśmy model serca myszy in situ, jak opisano wcześniej (45, 46). Krótko, Cx43 + /. myszy znieczulono pentobarbitalem sodu (80 mg / kg ip). Temperaturę zwierząt utrzymywano na stałym poziomie między 36,6 a 37,4 ° C z użyciem poduszek grzejnych, a elektrokardiogram był monitorowany w sposób ciągły. Po intubacji (rurki z polietylenu-60) zwierzęta wentylowano z szybkością udaru 130 / min i objętością oddechową ml z powietrzem pokojowym uzupełnionym tlenem. Wykonano torakotomię pośrodkową i usunięcie tętnic. Lewa przednia opadająca tętnica wieńcowa była zamknięta 2. 3 mm dystalnie od czubka lewego przedsionka przy użyciu szwu jedwabnego 7.0 i małej rurki, aby utworzyć pułapkę. Po 10 minutach zgryzu serca reperfundowano przez 10 minut. Pod koniec protokołu serca szybko wycięto, ściany przednią i tylną rozdzielono, a mitochondria lub mitoplasty wyizolowano jak opisano powyżej (n = 3). Analiza Western blot. Mitochondria przygotowano jak opisano powyżej. Białka wytworzono z różnych frakcji izolacyjnych (jak wskazano) standardowymi metodami, jak opisano wcześniej (43). Stężenie białka oznaczono stosując komercyjny test białkowy (metoda BCA, Pierce)
[hasła pokrewne: łojotokowe zapalenie skóry głowy wypadanie włosów, ciasto z truskawkami moje wypieki, mmacore ]
[patrz też: łojotokowe zapalenie skóry głowy wypadanie włosów, najlepsza odzywka do rzes, masaż leczniczy kręgosłupa ]