Chimeryzm mieszany i tolerancja bez napromieniowania całego ciała w dużym modelu zwierzęcym ad

Właściwości immunogenetyczne rekombinowanych haplotypów tego stada i rekombinowanych wewnątrz-MHC opisano wcześniej (18, 19). Pobieranie i infuzja PBSC. Kolekcja PBSC została opisana wcześniej (20, 21). Schemat mobilizujący komórkę macierzystą obejmujący rekombinowany świński czynnik komórek macierzystych (pSCF, 100 .g / kg) w połączeniu z rekombinowaną świńską IL-3 (pIL-3; 100 .g / kg) (obie z Biotransplant, Boston, Massachusetts USA), z lub bez rekombinowanego ludzkiego G-CSF (rhu G-CSF, Amgen Inc., Thousand Oaks, California, USA), podawano podskórnie. Zbieranie PBSC osiągnięto za pomocą leukaferezy (COBE BCT Inc., Lakewood, Colorado, USA), począwszy od 5 dnia terapii cytokinami, i kontynuowano codziennie przez 3 lub 6 dni. PBSC, świeże lub zamrożone i szybko rozmrożone, doprowadzono do stężenia 2,0 x 108 / ml, a odpowiednią objętość podano przez linię dożylną w ciągu 15 do 20 minut. PBSC podawano w dniu 0. napromieniowanie tymiankiem. Napromienianie tiomikalne (TI) podano w dniu. 2. Napromieniowanie podawano do pojedynczego pola obejmującego grasicę, określoną przez oś x obejmującą szerokość szczęki i oś y obejmującą odległość od górnej części mostka do stawu skroniowo-żuchwowego. Średni rozmiar pola promieniowania wynosił 10 × 4 cm, a odległość od źródła wynosiła 78 cm. Określone pole napromieniowano 700 cGy lub 1000 cGy ze źródła irradiarza kobaltu z szybkością 175 cGy / min i do głębokości tkanki 2 cm. Zmniejszenie limfocytów T krwi obwodowej. Zmniejszenie limfocytów T uzyskano za pomocą odczynnika pCD3-CRM9, nowego zmutowanego koniugatu przeciw toksynie błon śluzowych CD3 przeciwko błonicy śluzowej (22). Dnia 2, 0,05 mg / kg pCD3-CRM9 podawano dożylnie zwierzętom biorcom. Leczenie CyA. Odbiorcy otrzymywali CyA przez rurkę żołądkową (Neoral; Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, New Jersey, USA) w dawce 15-30 mg / kg / dzień w podzielonych dawkach od dnia. do 30 dnia w celu utrzymania poziomu we krwi 300. 800 ng / mL. Przeciwciała i cytometria przepływowa. Następujące przeciwciała swoiste dla świń zastosowano do monitorowania zubożenia i odzyskiwania populacji komórek świni za pomocą cytometrii przepływowej po podaniu pCD3-CRM9 i wlewu PBSC: mysie przeciwciało anty-CD1 76-7-4 (mysie IgG2aK) (23); mysie przeciwciało anty-CD3 898H2-6-15 (mysie IgG2aK) (24); mAb anty-CD3a BB23-8E6 IgG1 i mAb anty-CD5 BB6-9G12 IgG1 dostarczone przez M. Pescovitza (Indiana University, Indianapolis, Indiana, USA, odnośnik 25). Cytometria przepływowa została przeprowadzona przy użyciu Becton Dickinson FACScan (San Jose, Kalifornia, USA). Nierozdzieloną heparynizowaną krew obwodową (PB) rozprowadzono w probówkach do barwienia (Falcon 2054) przy 100 .l / probówkę i przemywano dwukrotnie przy użyciu 2 ml buforu do cytometrii przepływowej (HBSS zawierający Ca2 + i Mg2 + / 0,1% BSA / 0,1% NaN3). Komórki barwiono optymalnymi stężeniami pierwotnego mysiego mAb przeciw świni (skoniugowanego nie skoniugowanego lub FITC) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Do barwienia pośredniego dodano kozie anty-mysie Ig (H & L) FITC (GAMF) (Sigma Immunochemicals, St. Louis, Missouri, USA) przez dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. W celu wykrycia komórek pokrytych immunotoksyną dodano sam drugi odczynnik. Aby określić procent komórek dawcy w populacjach komórek krwi obwodowej, PB inkubowano ze skoniugowanym z FITC swoistym dla monocytów / granulocytów sprzężonym z FITC mAb SWC3a 74-22-15 (Balb / c, IgG1K) (23) razem z dawcą swoiste skoniugowane z biotyną mAb 1038H-10-9 (B10.PD1, IgMK) specyficzne dla antygenu allelicznego trzody chlewnej (PAA) (26) lub monoklonalne przeciwciało IgG z kontrolą izotypową IgM, a następnie streptawidyna fikoerytryna (PESA, PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Czerwone krwinki zostały poddane lizie, a białe komórki utrwalono za pomocą roztworu do lizy FACS (Becton Dickinson) przed przejęciem. Dane analizowano za pomocą oprogramowania do analizy list listy Winlist (Verity Software House, Topsham, Maine, USA). W przypadku cytometrii przepływowej zawiesin komórek grasicy komórki rozprowadzano w probówkach po x 106 komórek na probówkę. Barwienie było identyczne jak tu już opisane, z tym wyjątkiem, że nie dodano roztworu do lizy FACS. Jodek propidyny dodano bezpośrednio przed pozyskaniem w celu wykluczenia martwych komórek. Histologia. Tkanki grasicy uzyskano przez kolejne biopsje. Skrawki tkanki utrwalone formalnie zostały wybarwione hematoksyliną i eozyną (H & E) i zbadane mikroskopowo. Do badań immunohistochemicznych grasicy u zwierząt otrzymujących pojedynczy haplotyp niezgodny z PBSC użyto zamrożonych tkanek, a skrawki wybarwiono mAb167-D4 (27), specyficznym dla SLAc klasy I (typ donorowy), stosując technikę pośredniej immunoperoksydazy. W celu identyfikacji linii komórek I klasy SLAc (komórki dawcy), zamrożone tkanki barwiono stosując sekwencyjną immunoperoksydazę i fosfatazę immunoalkalinową do wykrywania keratyny (DAKO A / S, Glastrup, Dania) lub ISCR3, specyficzne dla DR II klasy SLA.
[patrz też: czarna porzeczka odmiany, kimura chwyt, ankos zapasy warszawa ]
[więcej w: ciasto z truskawkami moje wypieki, czarna porzeczka odmiany, zapytaj trenera ]