białko c-Fos jako cel przeciwsteoblastogennego działania witaminy D i synteza nowych analogów czesc 4

Eksperymenty z użyciem pulsu ujawniły, że białko c-Fos w komórkach prekursorowych osteoklastów obróciło się gwałtownie z szacowanym okresem półtrwania wynoszącym mniej niż 2 godziny, jak podano dla innych typów komórek (16), podczas gdy leczenie 1, 25 (OH) 2D3 nie spowodowało dalszego przyspieszenia degradacji c-Fos (rys. 6, A i B). W doświadczeniach znakowania impulsowego, biosynteza białka c-Fos, która znacznie wzrosła po stymulacji RANKL, została zahamowana przez współtworzenie z l, 25 (OH) 2D3 (Figura 6C). Figura 61a, 25 (OH) 2D3 hamuje translację białka c-Fos w komórkach prekursorowych osteoklastów. Komórki prekursorowe osteoklastów izolowano ze szpiku kostnego myszy C57BL / 6J jako komórki adherentne M-CSFa. (A i B) Po stymulacji RANKL przez 24 godziny komórki progenitorowe osteoklastu znakowano pulsacyjnie przez 30 minut za pomocą 35S-metioniny, a następnie goniono zimną metioniną we wskazanych czasach w nieobecności lub przy obecności l, 25 (OH) 2D3. leczenie. Należy zauważyć, że degradacja białka c-Fos nie była przyspieszona przez l, 25 (OH) 2D3 (puste kółka), w porównaniu z komórkami traktowanymi podłożem (wypełnione kółka). (C) Po stymulacji RANKL przez 24 godziny, komórki progenitorowe osteoklastów znakowano pulsacyjnie przez 30 minut za pomocą 35S-metioniny pod nieobecność lub bez obecności (3, 25 (OH) 2D3. Znakowane białko c-Fos poddano immunoprecypitacji. Należy zauważyć, że biosynteza białka c-Fos stymulowana przez RANKL była hamowana przez traktowanie (3, 25 (OH) 2D3. Białko a-aktyny służyło jako kontrola obciążenia. Wcześniejsze eksperymenty z ablacją genu celowanego ujawniły fundamentalną rolę czynnika transkrypcyjnego Fos / AP-1 w rozwoju osteoklastów (17, 18), a ostatnie badania zidentyfikowały jego kluczowe cząsteczki docelowe (19. 21). Jak podano, stymulacja RANKL indukowała 2 znaczące geny docelowe c-Fos, NFATc1 i IFN-y, które regulują różnicowanie osteoklastów odpowiednio i ujemnie (Figura 7A). Jednoczesne traktowanie (1, 25 (OH) 2D3 hamowało indukcję tych docelowych cząsteczek czynnika transkrypcyjnego c-Fos (Figura 7A); to odkrycie można uznać za dowód, że (3, 25 (OH) 2D3, poprzez tłumienie poziomu białka c-Fos, funkcjonalnie tłumi jego aktywność transkrypcyjną. Tak więc można sobie wyobrazić, że supresja białka c-Fos odgrywa ważną rolę w funkcjonalnej interferencji (3, 25 (OH) 2D3 z osteoklastogenezą. Figura 7c-Fos białko jako cel działania przeciwko osteoklastogennemu 1, 25 (OH) 2D3. Komórki prekursorowe osteoklastu wyizolowano ze szpiku kostnego myszy C57BL / 6J jako komórki adherentne M-CSFa i traktowano RANKL (40 ng / ml) przez 24 godziny pod nieobecność lub obecność wskazanych dawek 1, 25. (OH) 2D3. (A) Analiza Northern blot docelowych genów c-Fos, tj. NFATc1 i IFN-a, w traktowanych RANKL komórkach prekursorowych osteoklastów bez lub z (3, 25 (OH) 2D3 przez 24 godziny (10. 7 M). (B) Wymuszona ekspresja c-Fos (oznaczona przez a + A) przez wektor retrowirusowy znosi efekt supresyjny (3, 25 (OH) 2D3 na rozwój osteoklastów. Komórki prekursorowe osteoklastów wyizolowane ze szpiku kostnego zakażono retrowirusowym wektorem kodującym c-Fos i hodowano z M-CSF i RANKL przez 3 dni pod nieobecność lub bez obecności (3, 25 (OH) 2D3. Dane wyrażono jako procent wartości dla hodowli traktowanych podłożem bez zakażenia retrowirusowego (.). * P <0,05 w porównaniu do grupy zakażonej wirusem, n = 6. Aby udowodnić, że hamowanie indukcji białka c-Fos przez RANKL za pośrednictwem 25 (OH) 2D3 było odpowiedzialne za hamujące działanie hormonu na różnicowanie osteoklastów. , transfekowaliśmy komórki prekursorowe osteoklastów za pomocą retrowirusowego wektora kodującego białko c-Fos, a następnie zbadano je pod kątem zdolności l, 25 (OH) 2D3 do tłumienia tworzenia osteoklastów. Przymusowa ekspresja białka c-Fos znosi efekt supresyjny (1, 25 (OH) 2D3 na osteoklastogenezę całkowicie przy 10. 9 M i częściowo przy 10. 8 M (Figura 7B). Analogi witaminy D, które redukują białko c-Fos i hamują różnicowanie osteoklastów silniej niż naturalny hormon. Stwierdzenie, że zahamowanie c-Fos stanowi podstawę funkcji przeciwstukowej VDR sugeruje, że dawna aktywność może być stosowana do badania przesiewowego analogów witaminy D dla tych z silniejszą funkcją antyresorpcyjną niż naturalny hormon, 1., 25 (OH) 2D3. Przeszukując nowo syntetyzowane związki witaminy D, zidentyfikowaliśmy 2 analogi, DD280 i DD281, które znacznie silniej obniżały poziom białka c-Fos niż 1, 25 (OH) 2D3 (Figura 8, A i B). Gdy analogi testowano w hodowlach mysich ze szpiku kostnego, było oczywiste, że przez obniżenie poziomu białka c-Fos, te analogi powodowały silniejsze hamowanie rozwoju osteoklastów niż naturalny hormon (Figura 8C). Figura 8 Badanie na obecność analogów witaminy D (VD), które zmniejszają białko c-Fos i hamują różnicowanie osteoklastów silniej niż 1, 25 (OH) 2D3. Efekty 1. 25 (OH) 2D3 (puste kółka) i jego analogi (DD281, DD280 i DD208) na c-Fos [patrz też: powiększone węzły chłonne w jamie brzusznej, mleko w proszku dla dzieci, łojotokowe zapalenie skóry głowy wypadanie włosów ] [podobne: najlepsza odzywka do rzes, masaż leczniczy kręgosłupa, koszt rezonansu magnetycznego ]