białko c-Fos jako cel przeciwsteoblastogennego działania witaminy D i synteza nowych analogów cd

Obecność 2D3 w okresie 6-dniowej hodowli nie powodowała dalszej inhibicji osteoklastogenezy. Tak więc, chociaż (3, 25 (OH) 2D3 jest dobrze znane ze swojej aktywności antyproliferacyjnej w różnych typach komórek (15), w tym przypadku zależny od RANKL etap różnicowania komórek progenitorowych osteoklastu był specyficznie hamowany przez l, 25. (OH) 2D3. Figura 31a, 25 (OH) 2D3 hamuje indukowane przez RANKL końcowe różnicowanie do osteoklastów. (A) Komórki prekursorowe osteoklastów izolowano ze szpiku kostnego myszy WT C57BL / 6J. Komórki te hodowano w obecności 30 ng / ml M-CSF bez lub ze wzrastającymi dawkami (3, 25 (OH) 2D3 przez 3 dni, a proliferację komórek oceniano jak opisano w Methods. (B) Komórki szpiku kostnego hodowano z M-CSF przez pierwsze 3 dni (pierwszy okres), a następnie RANKL oprócz M-CSF przez ostatnie 3 dni (drugi okres). Obecność (3, 25 (OH) 2D3 przy 10. 8 M jest wskazana przez a + .. Należy zauważyć, że obecność (3, 25 (OH) 2D3 tylko w tym ostatnim okresie była wystarczająca do hamowania tworzenia komórek wielojądrzastych TRAP-dodatnich, podczas gdy jego obecność w poprzednim okresie wzrostu komórek zależnych od M-CSFa nie hamowała osteoklastogenezy. Gdy komórki prekursorowe osteoklastów zostały wyizolowane ze szpiku kostnego myszy z niedoborem VDR, efekt supresyjny 1. 25 (OH) 2D3 na osteoklastogenezę nie był obserwowany w ogóle, nawet przy najwyższej dawce 10. 7 M (Figura 2B) . Wzięte razem z ekspresją VDR w komórkach prekursorowych osteoklastów (Figura 2C), te dane wskazują, że (3, 25 (OH) 2D3 działa bezpośrednio na prekursory osteoklastów i hamuje ich różnicowanie w dojrzałe osteoklasty i że ten efekt jest pośredniczony przez VDR . białko c-Fos jako cel działania przeciwko osteoklastogennemu 1., 25 (OH) 2D3. W celu wyjaśnienia mechanizmu, w którym (3, 25 (OH) 2D3 hamuje przekazywanie osteoklastogenne w komórkach prekursorowych, badaliśmy wpływ (3, 25 (OH) 2D3 na cząsteczki, które są znane z przekazywania sygnałów z receptora RANK. Analiza Western blot wykazała, że (3, 25 (OH) 2D3 nie wpływało na poziomy białka samego receptora RANK, podjednostek TRAF6, p65 i p52 NF-kB lub białka c-Jun (Figura 4A i dane nie pokazane) . Stymulacja RANKL spowodowała aktywację kinazy I (B, p38 i JNK, poprzez ich fosforylację; jednakże, (3, 25 (OH) 2D3 nawet przy 10 <7 M nie hamowało ich fosforylacji (Figura 4B). Przeciwnie, (3, 25 (OH) 2D3 hamowało indukcję białka c-Fos przez RANKL w sposób zależny od dawki, a tego wpływu na białko c-Fos nie obserwowano w komórkach pochodzących od myszy VDR KO (Figura 5A). ). Leczenie samym 1, 25 (OH) 2D3 nie miało wpływu. Te wyniki sugerują, że (3, 25 (OH) 2D3 blokuje indukcję przez RANKL białka c-Fos, składnika czynnika transkrypcyjnego AP-1, tym samym antagonizując jego funkcję transkrypcyjną w jądrze. Figura 41a, 25 (OH) 2D3 nie hamuje szlaków NF-kB i p38 / JNK w komórkach prekursorowych osteoklastów. Komórki prekursorowe osteoklastu wyizolowano ze szpiku kostnego myszy C57BL / 6J jako komórki adherentne M-CSFa i traktowano RANKL (40 ng / ml) przez 24 godziny pod nieobecność lub w obecności 10. 8 M1 ., 25 (OH) 2D3. Ekspresję białek RANK, p65, p52 i c-Jun (A) i fosforylację I (B (I (Bp), p38 (p38-p) i JNK (JNK-p) (B) analizowano metodą Western blotting. po leczeniu RANKL przez 15 minut. Białko a-aktyny służyło jako kontrola obciążenia. Figura 51a, 25 (OH) 2D3 hamuje ekspresję białka c-Fos indukowanego przez RANKL. Komórki prekursorowe osteoklastów izolowano ze szpiku kostnego myszy WT C57BL / 6J i VDR KO jako komórki adherentne M-CSFa i traktowano RANKL (40 ng / ml) przez 24 godziny pod nieobecność lub obecność wskazanych dawek 1, 25 (OH) 2D3. Wykonano Western blotting dla białka c-Fos (A) i ilościowe analizy RT-PCR (B). RNA wyizolowano z komórek prekursorowych osteoklastów we wskazanych czasach po stymulacji RANKL, a ilościowy RT-PCR dla mRNA c-Fos przeprowadzono stosując LightCycler z EF-1. mRNA jako kontrola. Wypełnione koła, wypełnione trójkąty i otwarte kółka przedstawiają odpowiednio RANKL, RANKL plus 1, 25 (OH) 2D3 i pojazd. Białko a-aktyny służyło jako kontrola obciążenia (A). Co ciekawe, znaczne obniżenie poziomu białka c-Fos nastąpiło przy niewielkiej zmianie poziomu mRNA c-Fos. Kwantyfikacja poziomu mRNA c-Fos za pomocą ilościowej analizy RT-PCR ujawniła znaczny wzrost po stymulacji RANKL, osiągając maksimum w 6 godzin, ale (j, 25 (OH) 2D3 tylko nieznacznie zahamował ten wzrost mRNA c-Fos w tym punkcie czasowym. (Figura 5B), sugerując, że mechanizm potranskrypcyjny jest zaangażowany w supresję białka c-Fos za pośrednictwem VDR [podobne: masaż leczniczy kręgosłupa, trening pod sztuki walki, masaż nuru na czym polega ] [przypisy: techniki mma, kimura chwyt, łojotokowe zapalenie skóry głowy wypadanie włosów ]