białko c-Fos jako cel przeciwsteoblastogennego działania witaminy D i synteza nowych analogów ad 8

Moczową deoksypirydynolinę mierzono za pomocą zestawu do oznaczania PYRILINKS-D (Metra Biosystems Inc.). Test osteoklastogenezy in vitro. Komórki szpiku kostnego izolowano z kości piszczelowej i udowej u myszy w wieku 6 do 9 tygodni myszy C57BL / 6J (SLC) i myszy VDR KO (dostarczone przez Shigeaki Kato, University of Tokyo, Tokio, Japonia). Wszystkie komórki wysiano na płytki hodowlane zawierające P-MEM / 10% dezaktywowanych termicznie FBS / 1% antybiotyków i inkubowano przez 12 godzin. Nieprzylegające komórki oddzielono i hodowano przez 3 dni za pomocą M-CSF (30 ng / ml), a następnie te, które stały się adherentne, zastosowano jako komórki prekursorowe osteoklastów. Komórki traktowano RANKL (40 ng / ml) pod nieobecność lub w obecności l, 25 (OH) 2D3 przez 3 dni, utrwalano w 4% paraformaldehydzie i barwiono na TRAP. Wielonukleowane (a 3 jądra), komórki pozytywne wobec TRAP były liczone jako osteoklasty. Komórki prekursorowe osteoklastów hodowano w obecności 30 ng / ml M-CSF bez lub ze wzrastającymi dawkami (3, 25 (OH) 2D3 przez 3 dni, a proliferację komórek oceniano stosując zestaw do liczenia komórek-8 (Dojindo Laboratories). . Analizy zachodnie i północne. Ekstrakty z całych komórek izolowano z prekursorów osteoklastów, a stężenia białek oznaczano za pomocą zestawu do oznaczania białek Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). Równoważne ilości białka naniesiono na SDS-PAGE przy 4 x 20%, a białka przeniesione na membranę wykrywano za pomocą systemu do wykrywania Western blot ECL Plus (Amersham Biosciences). Fosforylację JNK, p38 MAPK i kinazy I (3 oceniano przy użyciu zestawów z Cell Signaling Technology. Całkowity RNA wyizolowano za pomocą odczynnika TRIzol (Invitrogen Corp.), zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku analizy Northern równe ilości całkowitego RNA (10 .g / ścieżkę) frakcjonowano na 1,5% żelu agarozowym. Specyficzne mRNA wykryto przez hybrydyzację membran nylonowych Hybond N + (Amersham Biosciences) z znakowanymi 32P cDNA dla mysich c-Fos, IFN-a i NFATc1. W przypadku ilościowego RT-PCR całkowite RNA (1 .g) poddano odwrotnej transkrypcji z użyciem SuperScript III (Invitrogen Corp.), a próbki analizowano przy użyciu LightCycler (Roche Diagnostics Corp.). Startery obejmowały 5 (3-ACCTGTTCGTGAAACACACCA-3. i 5a-ACAACACACTCCATGCGGTTT-3. dla c-Fos, 5. -GGACATTGGCATGATGAAGG-3. i 5. -CTCAGACTGTCCTTCAAGGC-3. dla VDR i 5. -TGCTGCCATTGTTGATATGG-3. i 5. -TCCACAGCTTTGATGACACC-3. dla EF-1 .. Ilość mRNA c-Fos i VDR została skorygowana przez ilość EF-1. mRNA. Eksperymenty z etykietowaniem pulsem i etykietowaniem impulsów. W przypadku znakowania impulsowego, prekursorowe komórki osteoklastów stymulowano RANKL przez 24 godziny pod nieobecność lub przy obecności l, 25 (OH) 2D3 przy 10. 7 M, a następnie radioznakowano przez godzinę pożywką hodowlaną zawierającą 150. Ci / ml 35S-metionina i mieszanina cysteiny (Amersham Biosciences). W przypadku znakowania za pomocą łańcucha impulsowego, traktowane RANKL prekursory osteoklastów podobnie radioznakowano, a następnie inkubowano w obecności nieradioaktywnej pożywki zawierającej 10 mM zimnej metioniny i 10 mM zimnej cysteiny przez różne okresy czasu. Ekstrakty komórkowe poddano immunoprecypitacji przeciwciałem anty-C-Fos, a osady poddano następnie SDS-PAGE. Po wysuszeniu żeli wykonano autoradiografię. Retrowirusowa ekspresja białka c-Fos. Wektor retrowirusowy kodujący mysz c-Fos (pBabe-cFos, uprzejmie dostarczony przez K. Matsuo, Keio University, Tokio, Japonia) został wykorzystany do transfekcji komórek do pakowania retrowirusów Plat-E (prezent od T. Kitamura, University of Tokyo, Tokio , Japonia). Pożywki hodowlane zebrano 48 godzin po transfekcji i trzymano jako zapasy retrowirusa. Komórki prekursorowe osteoklastów eksponowano na retrowirusa w obecności polibrenu (8 .g / ml) przez dzień, a następnie traktowano RANKL i (3, 25 (OH) 2D3 przez 4 dni w obecności puromycyny (1,6 .g). / ml). Różnicowanie osteoklastów oceniano jak opisano powyżej. Statystyka. Dane zostały wyrażone jako średnie. SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą ANOVA, stosując oprogramowanie do analizy statystycznej (SAS Institute Inc.). Istotność różnic określono przy użyciu dwustronnego testu Student i testu wielokrotnego Dunnetta. Wartość P <0,05 została uznana za znaczącą różnicę. Podziękowania Dziękujemy Shigeaki Kato i Toshio Kitamura (University of Tokyo) za dostarczenie myszy VDR KO i wektorów retrowirusowych, odpowiednio; Koichi Matsuo, Sunao Takeshita i Ken Watanabe (Narodowe Centrum Geriatrii i Gerontologii) za cenne sugestie; Mie Suzuki (Narodowe Centrum Geriatrii i Gerontologii) za fachową pomoc techniczną; oraz Akemi Ito (Niigata Bone Science Institute) do dyskusji na temat danych dotyczących histomorfometrii kości Badanie to zostało częściowo wsparte dotacjami z programu Badania porównawcze starzenia się i zdrowia Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej Japonii (K. K. Ikeda) oraz dotacji z Programu Promocji Podstawowych Studiów Nauk o Zdrowiu Narodowego Instytutu Innowacji Biomedycznych Japonii (MF-14 to K. Ikeda). Przypisy Niestandardowe stosowane skróty: BMD, gęstość mineralna kości; 1, 25 (OH) 2D3, (3, 25-dihydroksywitamina D3; OPG, osteoprotegeryna; OVX, wycięte jajniki; RANK, aktywator receptora NF-kB; RANKL, ligand RANK; TRAP, kwasoodporna kwasowa fosfataza; VDR, receptor witaminy D. Konflikt interesów: E. Ogata jest członkiem zarządu Chugai Pharmaceutical Co., która produkuje aktywne pochodne witaminy D w leczeniu chorób kości. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.116: 528 535 (2006). doi: 10,1172 / JCI24742 [przypisy: goździki właściwości lecznicze, najlepsza odzywka do rzes, mleko w proszku dla dzieci ] [podobne: ciasto z truskawkami moje wypieki, czarna porzeczka odmiany, zapytaj trenera ]